分类：医学论文 时间：2021-10-16 热度：321
摘要：外泌体是一类由细胞分泌的含有脂质、蛋白、核酸等多种物质的纳米级囊泡，主要参与细胞间的物质交换及信息传导，与多种疾病的发生发展密切相关。对外泌体进行深入研究，理解其生物学功能，对疾病诊断与治疗具有重要意义。由于外泌体尺寸较小且密度和体液接近，想要对复杂生物样本中的外泌体进行分离与分析十分困难。传统的外泌体分离方法如超速离心、超滤等大都需要借助大型仪器设备，且耗时长、操作复杂。因此迫切需要开发高效、便捷的外泌体分离检测手段。微流控技术因其微型化、高通量、可集成等特点，为外泌体的分离分析提供了一个新的平台。该文主要对近年来微流控技术在外泌体分离分析相关领域的研究进展进行了综述。重点从外泌体物理特性和生化特性两个角度出发，介绍了微流控芯片技术用于外泌体分离领域的主要原理、策略和方法。此外，还介绍了微流控技术与荧光、电化学传感、表面等离子体共振等多模态检测方法结合，实现外泌体一体化分析的新进展。最后，该文分析了目前微流控技术用于外泌体分离检测存在的挑战，并对其发展趋势和前景进行了展望。随着微流控外泌体分离分析装置的不断微型化、集成化、自动化，微流控芯片技术将在外泌体分离、生化检测、机制研究等方面将发挥越来越重要的作用。
关键词：外泌体;微流控技术;分离分析
外泌体是一类由细胞分泌的含有脂质、蛋白、核酸等多种物质的纳米级囊泡，其尺寸为30～150nm[1-3](见图1)。外泌体在人体中分布广泛，人体的外周血、尿液、乳汁、羊水等体液中均含有外泌体[4，5]。因外泌体可携带蛋白、运送RNA，其在人体中的角色主要包括物质的传递以及信息的传导两个大方面[6，7]。据此，人们将外泌体分为两种类型，第一种为有免疫活性的外泌体，其主要在抗原呈递和共刺激中发挥作用，第二种则是含有数量可观的RNA并可介导细胞间的遗传物质交流的外泌体[8，9]。外泌体与细胞的作用方式主要包括通过受体与靶细胞相互作用，激活下游细胞内的信号，以及直接与细胞膜融合从而将外泌体的膜蛋白整合到细胞浆膜或者是通过内吞作用将其转运分子传递至靶细胞的胞浆内。随着研究的深入，人们发现外泌体在适应性免疫[10，11]、炎症过程、胚胎形成[12]、肿瘤的发生与发展过程[13，14]中均发挥了重要的作用。以肿瘤为例，外泌体可以通过调节免疫功能，促进肿瘤血管新生以及肿瘤转移，或者直接作用于肿瘤细胞影响肿瘤进展[15-18]，因而外泌体获得了越来越多科学工作者的关注[19]。
外泌体尺寸较小且其密度和体液接近，想要精准地对外泌体进行分离与检测十分困难。在过去的十几年中，微流控芯片技术因其具有微型化、高通量、可集成及低消耗等特点，为外泌体的精准分离分析提供了一种潜在平台。本文主要介绍了微流控芯片技术在外泌体分离分析相关研究领域的进展，并对其发展前景予以展望。表1不同外泌体分离方法的比较
1现有的外泌体分离方法
外泌体的高效分离与富集是对其研究的前提条件，目前较为常用的外泌体分离方法主要有超速离心、超滤、免疫亲和捕获、聚合物共沉淀以及基于微流控技术的外泌体分离方法等5种(见表1)。
1.1超速离心法
超速离心[20]分离外泌体是通过离心力作用使不同密度、大小的物质分离开来。主要可以分为两类：一类为差速离心，一类为密度梯度离心。
差速离心即通过改变离心的速度，从而改变离心力的大小，使不同密度的物质分级分离。在分离外泌体时，便是通过不断提高离心机的转速，先将细胞及细胞碎片分离出来，最后再将尺寸较小的外泌体分离出来。而密度梯度离心则是使用一种密度能形成梯度(在离心管中其密度从上到下连续增高)又不会使所分离的物质凝聚或失活的溶剂系统对样本进行分离的方法。离心后各物质颗粒能够按其各自的比重平衡在相应的统计密度中形成区带，较为常用的密度梯度溶剂是蔗糖。实验结果表明，当采用蔗糖为梯度溶剂时，样品中的外泌体将在1.13～1.19g/mL的密度范围内富集[21]。采用超速离心法通常较为耗时，且对设备依赖程度较高，以离心力为驱动力还有可能对囊泡造成损害，导致外泌体的破碎与损失。
1.2超滤法超滤[22]即在一定的压力作用下，使待分离液体通过具有一定孔径的特制薄膜，尺寸小于薄膜孔径的物质将通
过薄膜，而尺寸大于薄膜孔径的物质将被截留在薄膜上。外泌体的尺寸一般为40～100nm，因而可以通过利用不同截留尺寸的超滤膜将外泌体从样品中分离出来。使用超滤法分离外泌体操作简单，但是超滤所使用的压力可能会导致囊泡的形变和破裂，且膜孔易堵塞，使用该分离方法最终结果可能导致蛋白污染较多。
1.3免疫亲和捕获法
基于免疫亲和捕获分离外泌体，主要依据是外泌体表面含有其特异性标记物，如CD9、CD63等。在平面或磁珠上包被抗标记物的抗体，当外泌体经过此平面或磁珠时，便可以与抗体结合从而分离出来[23，24]。此外，不同细胞分泌的外泌体其表面含有的抗原存在差异，可通过选择不同的抗体实现对不同的外泌体的提取与分离[25]。使用免疫亲和捕获法来捕获外泌体，特异性高、操作简便且不影响外泌体形态的完整性，但是效率较低，抗体价格昂贵，存在活性和批次差异。
1.4聚合物共沉淀法
共沉淀法分离外泌体是通过在待分离样品中加入其他溶剂，改变样品中物质的溶解度及分散特性，从而将外泌体从溶液中分离出来。目前报道的最常用的共沉淀剂是聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)[26]，PEG可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早期人们[27]将其应用于从血清等样品中提取病毒，现在也被用来提取外泌体，加入PEG后先将沉淀出的蛋白等物质分离出来，然后静置，利用各物质沉淀速率不同将其分离。使用PEG沉淀法操作简单，但纯度和回收率较低，且聚合物的除去较为困难，因此想要广泛应用仍需要不断改进技术条件。图2基于纳米孔膜、纳米阵列过滤分离外泌体的微流控方法
2基于微流控技术的外泌体分离方法
目前基于微流控技术的外泌体分离方法主要分为两大类。一类是基于外泌体物理性质如尺寸等的分离方法，另一类为基于外泌体生化特性如表面蛋白表达等的分离方法[28]。
2.1基于外泌体物理特性的分离方法
针对外泌体物理特性进行分离的研究主要集中在尺寸差异上，外泌体的尺寸为30～150nm，而细胞的尺寸一般在微米数量级，其他的细胞外囊泡如微囊泡以及凋亡小体的大小也和外泌体存在差异，因而可以利用它们尺寸的差异将外泌体从混合物中分离出来。和其他的分离方法相比，使用基于尺寸的方式分离出的外泌体大小更加均一。在微流控芯片中，基于外泌体尺寸进行分离主要有两大类。一类为使用纳米孔膜、纳米阵列、微过滤器等器件结构直接对样品进行过滤，将外泌体从中分离出来。另一类使用流场技术，通过施加动力作用或场作用使外泌体和其他物质分离开。此外，也可以将这两种方式结合进行外泌体的分离，在接下来的文章当中将对这两类分离方式进行详细介绍。
2.1.1纳米孔膜、纳米阵列过滤
在最近的研究中，有学者[29]报道了一种使用双层膜过滤分离尿液中外泌体的体系(见图2a)：该微流控芯片的核心部分是两个滤膜，作者将经过离心前处理的样品加入芯片中，样品先流经孔径为200nm的滤膜，去除样品中体积较大的物质如细胞碎片和一些较大的囊泡等;之后样品又流经一个孔径为30nm的滤膜，此时样品中尺寸小于200nm大于30nm的物质都将被截流下来。后期可以直接在此芯片中对截流下的外泌体进行染色等操作。相较于传统的超速离心方式，双层膜过滤耗时短，设备简单。该装置的外泌体捕获率为81.3%，特异性为90%。Woo等[30]也利用了双层膜过滤的方式对外泌体进行分离(见图2b)，他们将驱动力改成了离心力，装置可以实现对血液中尺寸为20～600nm的囊泡的富集，分离效率大于95%。此外，也有学者[31]利用膜过滤的方式，研究出了外泌体分级分离的芯片(exosometotalisolationchip，ExoTIC);该芯片的构造和过滤器类似，通过改变中间夹膜的孔径，实现对不同尺寸物质的截留。而将具有不同滤膜孔径的芯片串联起来，便可以实现对外泌体的分级分离;分离后将滤器中间的滤膜取出，并将其上截留的外泌体溶解到溶剂中去，实现对不同尺寸外泌体的分离与富集。
确定性侧向位移(deterministiclateraldis-placement，DLD)柱形微流控芯片是一种可以有效分离和富集微米级颗粒包括血液中的寄生虫、细菌、血细胞和循环肿瘤细胞等物质的技术。来自IBM、普林斯顿大学与西奈山伊坎医学院的科学家们合作设计并制造出了纳米级DLD(nano-DLD)芯片[32]，该芯片具有25～235nm范围的均匀的间隙尺寸;经过实验他们发现，在低佩克莱数情况下，扩散和确定性位移产生竞争时，nano-DLD芯片仍然可以灵敏地将20～110nm的颗粒分开。
无独有偶，来自美国纳米医学中心的研究者同样利用柱型微流控芯片实现了对外泌体的分离[33]。与前者不同的是，他们通过在形成的阵列微米柱上构建多孔硅的纤毛从而实现对外泌体的捕获与富集;通过控制合成条件，可以获得不同的纤毛形态及密度。当细胞、细胞碎片、外泌体以及蛋白等流经该带纤毛的微米柱阵列时，细胞以及细胞碎片因为体积过大，不能够被纤毛捕获，外泌体则可以被纤毛捕获，而蛋白等生物小分子因体积过小，会从纤毛的间隙溜走，因而此带有多孔硅纳米线的微柱阵列可以实现对外泌体的分离与富集。在实现捕获后可以通过加入磷酸盐缓冲液将多孔的纳米线结构溶解掉，从而将捕获到的外泌体完整地释放出来。
2.1.2物理场分选
除了使用器件对样品进行直接过滤，人们也在微流控芯片上使用流场技术对外泌体进行分离[34]：杜克大学的学者利用声学技术和微流控芯片技术相结合(以下简称声波微流控)，设计了一种可以不用标记及直接接触便可以实现外泌体分离和富集的方法。该声波微流控平台包含细胞去除以及外泌体分离两个模块。当施加一定频率的声波时，流体中的微粒将会受到声波辐射力的作用，其大小和粒子的体积成正比。而当微粒受到声波辐射力影响要发生位置的偏移时，又会受到一个斯托克斯拽力的作用，其大小与粒子的半径成正比。当粒子的体积增大10倍时，斯托克斯拽力增大10倍，而声波辐射力增大1000倍，因而体积越大的微粒，受声波场的影响就越明显，运动轨道偏移越大，利用此原理便可以将不同尺寸大小的粒子分离开来。使用该平台所获得的外泌体血液细胞的去除率达到99.999%。
将电场和磁场结合到微流控芯片上进行外泌体的分离近来也有报道。Cho等[35]提出了利用电场迁移来分离外泌体的方法。该方法在孔径为30nm的渗透膜施加穿透膜的电场，在电场的作用下蛋白等发生迁移从而透过膜到外侧，而外泌体则会被截留在渗透膜上从而实现分离与富集。该方法分离效率较高，在尺寸上可以达到和超速离心类似的分离结果。和传统的超速离心方法相比，该种分离方式在RNA水平上的回收率为65%，比超速离心高了7.9倍，蛋白的去除效率在30min内可以达到83.6%。
相关知识推荐：论文发表英文期刊如何减少语言错误
此外，也有学者[36]提出了一种利用黏弹流对外泌体进行分离的方法(见图3)，该方法通过在样品中加入一种具有生物相容性的聚合物来控制作用在外泌体上的黏弹力从而实现对外泌体的分离，通过选择合适的浓度峰参数，最终所分离出的外泌体的纯度可大于90%，回收率大于80%。
2.2基于外泌体生化特性的分离方法
目前针对外泌体生化特性进行分离的研究主要集中在表面蛋白表达的差异上，通常通过免疫捕获的方式将外泌体从样本中分离出来。免疫捕获即将和外泌体相关的抗体吸附在固相载体表面，从而对外泌体进行捕获的技术。该技术具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点，因而被广泛使用。在微流控系统中采用免疫捕获的方式分离外泌体，从基底的状态上分可以分为固定基底免疫捕获和非固定基底免疫捕获两种。
2.2.1固定基底免疫捕获
顾名思义，固定基底免疫捕获就是将捕获所需的抗体修饰在平面或有结构的基底上，但基底本身不可移动。较常用来作为标记物的蛋白是外泌体特异性的CD9、CD63以及CD81，此外针对一些具有自己特异性蛋白的外泌体，也可以用相应的蛋白抗体来进行捕获，如EpCAM[37]等蛋白。有学者[38]设计并制造了一种可以实时对外泌体进行定量分析的技术，该技术通过在平面底部修饰上外泌体特异性蛋白的抗体，实现对外泌体的捕获，接着通过表面等离子体成像(surfaceplasmonresonanceimaging，SPRi)对信号进行分析。此外，将具有纳米结构的氧化石墨烯和聚多巴胺修饰在平面上，再修饰上捕获外泌体的抗体可以显著提高外泌体的捕获效率[39](见图4a)。图4基于固定基底免疫捕获分离外泌体的微流控方法
Kang等[40]则提出了一种可以实现外泌体可逆捕获和释放的装置(见图4b)。该装置由两个不同的被免疫标记的具有结构的聚二甲基硅氧烷层组成，图案的设计结合机械旋转可以有效地提高抗体与外泌体结合的概率，从而可以在获得高的特异性的同时也获得高的外泌体的通量。作者在修饰过程中使用了具有双硫键的DTSSP(3，3′-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯))这一物质，在捕获完成后，加入具有还原性的DTT(二硫苏糖醇)便可以成功地使双硫键断裂开，从而使所捕获到的外泌体被释放出来，以便于下游的进一步分析。
此外，人们也将一些微结构应用到了对外泌体的捕获上，如鱼骨结构[41，42]、三角结构等，这些微纳结构的加入，不仅可以增大捕获底面的比表面积，还可以增加液体的混合，提高捕获效率。Chen等[43]构建了一种纳米氧化锌包覆的三维支架芯片，三维支架相互连接的微孔使流体流动呈现混流或漩涡特征，氧化锌纳米线阵列为外泌体特异性抗体的固定提供了较大的表面积，纳米阵列具有尺寸排斥效应，对体积较大的囊泡有较好的去除作用。
2.2.2非固定基底免疫捕获
和固定基底免疫捕获相对应，非固定基底免疫捕获即将捕获抗体修饰在可移动的基底上，微珠是目前较为常用的非固定外泌体捕获基底。外泌体的尺寸只有30～150nm，直接分离的话较为困难，设备依赖性强。通过在微珠等表面修饰外泌体特异性的抗体等，便可以对外泌体进行捕获与富集。之后只要对捕获了外泌体的微珠进行操作便可以将外泌体分离出来，化小为大，操作将更为便捷。目前使用较多的微珠是磁珠和硅珠。Godwin等[44]将免疫捕获分离和外泌体的目标蛋白检测集合在微流控芯片上，开发了一种新的可以对外泌体蛋白直接进行分析检测的技术。该微流控芯片主要由两部分组成，第一部分为外泌体捕获单元，即加入修饰了抗体的磁珠，可以对外泌体进行捕获。第二部分为蛋白检测单元，加入蛋白提取剂，便可以在这个芯片上实现对外泌体蛋白的自动化检测。该实验装置可在100min内实现对30μL血液样品的检测。无独有偶，直接在芯片上实现对外泌体中的miRNA(micro-ribonucleicacid)检测的芯片也已有报道[45]，检测芯片由外泌体捕获、RNA捕获、反转录以及qPCR(quantitativereal-timepolymerasechainreac-tion)4个功能单元组成，外泌体在第一个腔室被表面标记有抗体的磁珠捕获后，加入RNA裂解液，裂解出的RNA进入到第二个腔室被捕获，之后洗脱出来，进入第三个腔室进行反转录，最后在第四个腔室进行qPCR，便可以对捕获的外泌体的RNA进行鉴定。此外，要对一种特定疾病的外泌体进行判定，有时需要同时对多个蛋白进行检测，这一点，也已经有学者利用免疫标记的磁珠实现[46]：研究人员以卵巢癌分泌的外泌体为例，用CD9的抗体来进行捕获，对CA-125、EpCAM、CD24这3种蛋白进行了免疫荧光标记，并对其光强等进行了检测，实验结果表明该方式可以实现对外泌体的多种标志蛋白的检测。图5基于非固定基底免疫捕获分离外泌体的微流控方法
而使用不带磁性的微珠进行捕获，通常是在捕获之后利用滤膜截流以及通过流场的作用将吸附了外泌体的微珠分离出来。Dudani等[47]提出了一种可以将外泌体分离与外泌体荧光检测同步进行的技术(见图5a)：作者使用了表面标记有CD63抗体的微球，将其和含有外泌体的样品以及表面标记有藻红蛋白的anti-CD81一起培养，之后再将微球和缓冲盐溶液一起从不同的入口注入微流控芯片中，在流体惯性力的作用下，微珠将迁移到缓冲液中，从而被分离出来;在微珠收集口处有个荧光检测器，可以实现对外泌体荧光的检测。除了使用相对外泌体而言体积较大的微珠，比外泌体尺寸小很多的磁性纳米颗粒[48]也被应用于对外泌体的分离中(见图5b)。通过在磁性纳米颗粒表面修饰上相应的抗体，可以使其和外泌体特异性结合而使外泌体带有磁性，接着便可以通过对磁场的操控将外泌体从磁性纳米孔(exosometrack-etchedmagneticnanopore，ExoTENPO)中分离出来[48]。——论文作者：陈雯雯1，2，甘忠桥1，2，秦建华1，2*
文章名称：微流控技术在外泌体分离分析中的研究进展
