分类：农业论文 时间：2022-02-12 热度：654
摘 要：本文以黑胡椒粉为原料，采用三相分离法(TPP)提取胡椒油树脂，研究了胡椒粉添加量、硫酸铵质量浓度、提取液与叔丁醇体积比、pH、温度对胡椒油树脂得率及胡椒碱含量的影响，并通过响应面试验优化了胡椒油树脂的提取工艺。结果表明：最佳提取条件为胡椒粉添加量 5%、硫酸铵质量浓度 10%、提取液与叔丁醇的体积比 1∶0.5、pH 4、温度 20 ℃，在此条件下，黑胡椒油树脂得率为 12.90%，黑胡椒油树脂中胡椒碱含量为 30.46%，验证试验与模型预测值基本相符。研究结果为工业化提取胡椒油树脂提供参考。
关键词：胡椒油树脂;三相分离法;胡椒碱;提取
胡椒(Piper nigrum L.)是一种多年生热带作 物，完全成熟后具有典型的攀援特征，胡椒的商业和营养潜力为其赢得了“香料之王”的美誉。由于惊人的香味，胡椒在食品行业中常被用作食品添加剂，具有防腐[1]和抗氧化作用[2]。在传统医学中用于治疗感冒、发烧和许多炎症性疾病[3-4]。
胡椒油树脂是采用有机溶剂提取胡椒中的风味活性物质所得的粘稠、颜色较深的膏状物，既包含了胡椒碱、胡椒精油以及色素等物质，也包含了胡椒主要的营养成分和药用成分，保持着胡椒特有的辛辣味，可以直接食用，能够改善食物香味，是一种重要的食品添加剂[5]。鉴于胡椒油树脂的诸多优点，在食品行业中，人们逐渐用胡椒油树脂代替胡椒粉和胡椒粒等产品。胡椒碱是胡椒辣味的来源主成分，其含量的高低可以用来评价胡椒油树脂的品质[6]。胡椒油树脂提取物具有抗炎、抗抑郁、镇痛、抗风湿等特性[7-9]。在与其他药物联合治疗癌症时，它增加了其他药物的生物利用度和有效性[10]。鉴于这些药用特性，有必要寻找一种既有效又高效的提取方法，以提高胡椒油树脂产量和质量。
胡椒油树脂的提取方法主要有溶剂浸提法[11]、微波辅助提取法[12]、超声波辅助提取法[13]、超声微波辅助提取法[14]和超临界 CO2 提取法[15]等。有机溶剂浸提胡椒油树脂的过程中，有机溶剂消耗大，胡椒油树脂有效成分可能会有损失。而且有机溶剂如乙醇、甲醇等沸点低，在工业化生产中易挥发，对环境污染大，不易回收，对于小型工厂来说难以满足安全生产的要求。微波辅助提取法和超声辅助提取法所得胡椒油树脂得率高，但需价格不菲的仪器购买和维护费用。超临界 CO2 提取法最大优势在于无有机溶剂残留，但操作过程中所需器材数量巨大且价格昂贵，对于胡椒油树脂中的非挥发性成分无法充分提取[16]。鉴于上述方法存在成本高、溶剂消耗量大、选择性差等缺点，全球正在寻找廉价、快速、绿色的萃取方式。
三相分离(three phase partitioning , TPP)法建立于 1982 年，是一种简单、较新的生物分离技术，被用于提取各种生物大分子。在微生物、植物或动物细胞匀浆中加入硫酸铵和叔丁醇，静置一段时间即可形成三相，由上至下依次为有机相(油脂等油溶性物质)、蛋白质层、水相(糖类等水溶性物质)[17]。一般情况下，叔丁醇与水完全混溶，但加入适当浓度的硫酸铵后，叔丁醇与水分层，且密度相差较大[17]。高浓度的硫酸铵赋予水较高的介电性，叔丁醇层实际上为疏水层，它被排除在水之外，将亲脂成分提取出来，极性成分集中在水相中[18]。
目前 TPP 已被研究者较多地用于酶和蛋白质的分离[19-23]，但利用 TPP 提取油脂物质的文献却很少。目前研究人员利用三相分离法从芒果仁、大豆[24]、米糠中提取油[25]，从姜黄[26]、生姜[27] 中提取油树脂，以及提取可可果仁脂肪[28]。
本研究采用三相分离法提取胡椒油树脂，并测定了胡椒碱含量，旨在得到胡椒碱含量较高的胡椒油树脂，并对其加工工艺进行响应面优化。研究了胡椒粉添加量、硫酸铵质量浓度、提取液与叔丁醇比例、pH、温度等工艺参数对油树脂得率及胡椒碱含量的影响。研究结果对扩展三相分离体系在油树脂提取方面的应用具有积极意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 黑胡椒粉(过 60 目筛)，由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供。
叔丁醇、硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、95%乙醇，均为分析纯，西陇化工股份有限公司;甲醇(色谱纯)，西陇化工股份有限公司;胡椒碱(标准品)，北京世纪奥科生物技术有限公司。 1.1.2 仪器与设备 AL04 电子天平，上海梅特勒托利多仪器有限公司;S475-B 多参数测试仪，上海梅特勒托利多仪器有限公司;MTV-100 多管旋涡混匀仪，杭州奥盛仪器有限公司;SY11 型电热恒温水浴锅，常州恒隆仪器有限公司; Avanti J-30I 高速冷冻型离心机，美国 Beckman Coulter 公司;IKA 旋转蒸发仪，广州仪科科技公司;Agilent 1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 三相分离法提取胡椒油树脂 取 0.5 g 胡椒粉末于 50 mL 离心管中，加入 10 mL 蒸馏水并充分混匀，加入一定质量硫酸铵，涡旋搅拌 5 min 使硫酸铵固体充分溶解之后用 1 mol/L 的 HCl 或 NaOH 溶液调节溶液 pH，然后按照与提取液体积比加入叔丁醇，涡旋搅拌 5 min，在特定温度水浴锅中静置 1 h，6400 r/min 离心 20 min，形成三相。将含胡椒油树脂的有机相转移至已称质量的旋转蒸发瓶中，旋转蒸发回收叔丁醇后得胡椒油树脂，旋转蒸发瓶烘干至恒重后称质量。
按照下列公式计算胡椒油树脂得率：
得率=提取所得胡椒油树脂质量/提取用胡椒粉质量×100%
1.2.2 胡椒碱的含量测定[29] 参照 GB/T 17528- 2009 的方法测定胡椒碱含量。具体为：量取 50 mL 95%乙醇于旋转蒸发瓶中，待油树脂完全均匀化后，吸取 1 mL 溶液至 100 mL 棕色容量瓶中，用 95%乙醇稀释至刻度线，稀释液经 0.45 μm 滤膜过滤后，用 HPLC 测定，采用外标法定量。色谱条件为：色谱柱为 C18(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)，流动相为甲醇水溶液(体积比为 77∶23)，流速为 1.0 mL/min，柱温为 30 ℃，检测器波长为 343 nm，进样量为 10 μL。
1.2.3 单因素实验 分别对胡椒粉添加量(2.5%、 5%、10%、15%、20%)、硫酸铵质量浓度(10%、 20%、30%、40%、50%)、pH(4、5、6、7、8)、提取液与叔丁醇的体积比(1∶0.5、1∶1、1∶1.5、 1∶2、1∶2.5)、温度(20、30、40、50、60 ℃)进行单因素实验，以胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量为考察指标，确定各因素的最佳选择范围。
1.2.4 响应面法实验设计 在单因素实验结果的基础上，利用 Design Expert 8.0.6 软件进行响应面优化实验，选择 pH、提取液与叔丁醇体积比、温度三个因素为自变量，以胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量为响应值，设计三因素三水平响应面实验，试验因素水平值及编码值见表 1。
1.3 数据分析
所有数据采用 Microsoft Excel 2016、SPSS 22.0、Design Expert 8.0.6、Origin 8.0 软件处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 胡椒粉添加量 由图 1 可知，随着胡椒粉添加量的增加，胡椒油树脂得率先急剧下降后逐渐趋于稳定，胡椒碱含量先下降后升高。胡椒油树脂得率随着胡椒粉添加量的增加而降低，可能是因为缺乏足够的水来完成硫酸根离子的水合作用。在三相分离过程中，水与硫酸铵一起构成水相，起到分散悬浮原料的作用。胡椒粉添加量为 2.5%时，胡椒油树脂得率达 24%，以 95%乙醇溶解旋转蒸发瓶中油树脂时，发现油树脂不能完全溶解，推断其中可能含有杂质;此外，考虑到放大生产时，胡椒粉添加量过低会带来溶剂消耗多和旋蒸时间长等成本增加的风险。综合考虑这两个原因，选择胡椒粉添加量为 5%进行下一步实验。
2.1.2 硫酸铵质量浓度 由图 2 可知，随着硫酸铵质量浓度的增加，胡椒油树脂得率降低，胡椒碱含量升高。硫酸铵质量浓度为 10%时，胡椒油树脂得率最高。综合考虑，选择硫酸铵质量浓度为 10%。
在三相体系形成过程中，溶液中硫酸铵解离出大量的 NH4 + 、SO4 2，解离出的离子结合水分子后产生盐析效应，使蛋白质疏水沉淀，由于蛋白质的析出与相结合的油脂析出息息相关，所以这可能是硫酸铵质量浓度影响油树脂得率的原因[19]。但具体作用情况依原料品种而定。Gaur 等[24]发现 50%的硫酸铵质量浓度为提取芒果仁油脂的最佳浓度，30%的硫酸铵质量浓度为提取大豆油和米糠油的最佳浓度。Varakumar 等[16]在提取生姜油树脂时，发现添加 10%的硫酸铵得到的生姜油树脂得率最高。
2.1.3 pH 由图 3 可知，随着 pH 的增加，胡椒油树脂得率先增加后降低，在 pH 为 5 时油树脂得率最高，油树脂中胡椒碱含量最低。胡椒油树脂得率和胡椒碱含量随着 pH 变化而变化的原因可能是，pH 影响三相体系中蛋白质层的析出，从而影响油树脂的析出。当溶液的 pH 小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，此时溶液中硫酸铵电离出的硫酸根阴离子可与蛋白质正电荷结合，使蛋白质结构紧缩、沉淀析出，而蛋白质层的析出又影响溶液中胡椒油树脂的析出，从而影 响油树脂中胡椒碱的含量[24]。
2.1.4 提取液与叔丁醇体积比 由图 4 可得，随着提取液与叔丁醇体积比增加，胡椒油树脂得率先升高后下降，之后趋于稳定，胡椒碱含量先下降后升高。在体积比为 1∶1 时油树脂得率最高。提取液与叔丁醇体积比从 1∶0.5 增加到 1∶1 时，油树脂得率增加，原因可能是叔丁醇的增加有助于单位体积内油树脂在水相和有机相间的传质。当提取液与叔丁醇体积比大于 1∶2 后胡椒油树脂得率趋于稳定可能是因为胡椒油树脂已大部分被提出。
2.1.5 温度 由图 5 可知，随着温度的升高，胡 椒油树脂得率先升高后下降，在 40 ℃时得率最高。油树脂中胡椒碱含量呈先下降后升高的趋势。油脂的溶出属分子扩散过程，温度升高，分子扩散系数增大，扩散速度提高，因而油树脂得率增加。但温度继续上升，油树脂得率下降，原因可能是过高的温度对三相体系稳定性造成一定的破坏。
2.2 响应面试验
2.2.1 试验设计与结果 进行三因素三水平的 Box-Benhnken 中心组合试验设计，考察 pH(A)、提取液与叔丁醇体积比(B)、温度(C)对胡椒油树脂得率与油树脂中胡椒碱含量的影响，试验设计及结果见表 2。
2.2.2 各因素间的相互作用 利用 Design-Expert 8.0.6 软件绘制因子间的响应曲面图，考察所拟合的响应曲面形状，分析因素间的交互作用对胡椒油树脂得率和树脂中胡椒碱含量的影响，其响应曲面分别见图 6 和图 7。
根据图 6 可以看出，提取液与叔丁醇体积比和温度对胡椒油树脂得率的影响最大，pH 和温度对胡椒油树脂得率的影响次之，对胡椒油树脂得率影响最小的是 pH 和提取液与叔丁醇体积比。
根据图 7 可以看出，pH 和温度对胡椒碱含量的影响最大，提取液与叔丁醇体积比和温度对胡椒碱含量的影响次之，pH 和提取液与叔丁醇体积比对胡椒碱含量的影响最小。
2.2.3 验证试验 经响应面分析，综合考虑胡椒油树脂的提取得率及胡椒碱含量，得到三相分离法提取胡椒油树脂的最佳工艺条件为 pH 4.00、提取液与叔丁醇体积比 1∶0.53、提取温度 20.19 ℃，预测的油树脂得率为 13.93%，胡椒碱含量为 31.83%。
为方便操作，修正后的提取条件为 pH 4、提取液与叔丁醇体积比为 1∶0.5、提取温度为 20 ℃，该条件下得到的胡椒油树脂得率为 12.90%，油树脂中胡椒碱含量为 30.46%。试验结果与理论值接近，说明响应曲面分析所得的模型具有参考价值。
3 讨论与结论
近年来随着胡椒在食品和医药方面的广泛应用，囊括了胡椒几乎所有香气成分的胡椒油树脂受到越来越多的关注，众多学者对胡椒油树脂的提取进行了研究。周雪敏等[11]采用有机溶剂(乙醇)浸提法提取胡椒油树脂，在响应面优化的工艺条件下，黑胡椒油树脂得率为 10.86%，黑胡椒油树脂中胡椒碱含量为 38.73%。周叶燕等[12]研究了微波辅助法提取黑胡椒油树脂，实验结果为黑胡椒油树脂的得率为 12.69%。吴桂苹等[30]以 95% 的乙醇为萃取溶剂，采用热回流提取、索氏抽提、超声波提取、微波提取、超声波-微波辅助等方法来提取胡椒油树脂，结果表明，超声-微波辅助提取可得到得率最高(17.23%)的胡椒油树脂，油树脂中胡椒碱含量为 42.20%。上述提取胡椒油树脂的方法都存在乙醇用量大、易挥发等缺点，且超声-微波辅助提取所用设备及设备维修昂贵，均限制胡椒油树脂的工业生产。周雪敏[31]采用超临界 CO2 提取胡椒油树脂，在最优条件下得到胡椒油树脂得率为 0.818%，树脂中胡椒碱的含量为 25.65%。该方法优势在于无有机溶剂残留、安全无毒，但胡椒油树脂得率低，且操作成本高。
三相分离法提取油树脂简单易操作，叔丁醇可回收，挥发到空气中的有机试剂含量小，对空气污染小。Varakumar 等[16]采用三相分离法提取生姜油树脂，在硫酸铵质量浓度 10%、生姜粉添加量 5%、提取液与叔丁醇体积比为 1∶0.5、pH 为 5 的条件下，生姜油树脂得率最高，为 17.3%。 Kurmudle 等[26]采用三相分离法提取姜黄姜油树脂，在硫酸铵质量浓度 30%、提取液与叔丁醇体积比为 1∶1 的条件下姜黄油树脂得率最高。
本研究采用三相分离法提取胡椒油树脂，考察胡椒粉添加量、硫酸铵质量浓度、pH、提取液与叔丁醇体积比和温度对胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量的影响。选择胡椒粉添加量为 5%，硫酸铵质量浓度为 10%，在单因素实验的基础上，选取 pH、提取液与叔丁醇体积比和温度为自变量，以胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量为响应值，根据 Box-Behnken 设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法优化提取工艺，建立了响应值和各个因素之间的数学模型。结果表明，三相分离法提取胡椒油树脂的最佳工艺条件为胡椒粉添加量为 5%、硫酸铵质量浓度为 10%、 pH 4、提取液与叔丁醇体积比 1∶0.5、温度 20 ℃，在最优条件下，胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量分别达 12.90%和 30.46%。三相分离法操作简便、耗时短、成本低，体系中的有机溶剂可以回收重复利用，有利于胡椒油树脂工业化生产。——论文作者：陈星星1,2，宋 丽2,3，谷风林2,4,5*，吴桂苹2,4,5，陶 锐6
参考文献
[1] Gupta S K, Bansal P, Bhardway R K, et al. Comparative anti-nociceptive, anti-inflammatary and toxicity profile of nimesulide vs nimesulide and piperine in combination[J]. Pharmacological Research, 2000, 41(6): 657-663.
[2] 张水平, 谷风林, 吴桂苹, 等. 胡椒果与胡椒叶抗氧化能力的比较[J]. 食品工业科技, 2013, 34(20): 130-134.
[3] Bagheri H, Abdul Manap M Y B, Solati Z. Antioxidant activity of Piper nigrum L. essential oil extracted by supercritical CO2 extraction and hydro-distillation[J]. Talanta, 2014, 121: 220-228.
[4] Mehmood M H, Gilani A H. Pharmacological basis for the medicinal use of black pepper and piperine in gastrointestinal disorders[J]. Journal of Medicinal Food, 2010, 13(5): 1086- 1096.
[5] 乔丽艳, 罗断节, 陈登峰, 等. 胡椒外用健康产品的开发研究[J]. 中国实用医药, 2008, 3(6): 151-153.
[6] 周雪敏, 朱科学, 房一明, 等. 黑胡椒油树脂乙醇浸提工艺研究[J]. 中国调味品, 2016, 41(10): 1-7.
[7] Mustapa A N, Martin Á, Mato R B, et al. Extraction of phytocompounds from the medicinal plant Clinacanthus nutans Lindau by microwave-assisted extraction and supercritical carbon dioxide extraction[J]. Industrial Crops and Products, 2015, 74: 83-94.
[8] Mandal V, Mohan Y, Hemalatha S. Microwave assisted extraction of curcumin by sample–solvent dual heating mechanism using Taguchi L9 orthogonal design[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2008, 46(2): 322- 327.
[9] Olalere O A, Abdurahman N H, Alara O R, et al. Parametric optimization of microwave reflux extraction of spice oleoresin from white pepper (Piper nigrum)[J/OL]. Journal of Analytical Science and Technology, 2017, 8: 8[2019-10-15]. https://doi.org/10.1186/s40543-017-0118-9.
[10] Janakiraman K, Manavalan R. Studies on effect of piperine on oral bioavailability of ampicillin and norfloxacin[J]. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 2008, 5(3): 257-262.
[11] 周雪敏, 朱科学, 房一明, 等. 黑胡椒油树脂乙醇浸提工艺研究[J]. 中国调味品, 2016, 41(10): 1-7, 11.
[12] 周叶燕, 樊亚鸣, 高绍中, 等. 动态-微波法提取黑胡椒油树脂的中试研究[J]. 食品科技, 2009, 34(11): 175-179.
[13] 李平凡, 聂青玉, 陈 鲁, 等. 超声法制备胡椒油树脂工艺研究[J]. 食品科技, 2010, 25(2): 60-62.
[14] 吴桂苹, 贾 雯, 谷风林, 等. 超声波-微波辅助溶剂提取胡椒鲜果油树脂的工艺研究[J]. 中国调味品, 2019, 44(5): 124-129.
[15] 周雪敏, 朱科学, 杨继敏, 等. 超临界法萃取的黑胡椒油树脂成分分析[J]. 热带农业科学, 2016, 36(2): 54-58. 82.
[16] Varakumar S, Umesh K V, Singhal R S. Enhanced extraction of oleoresin from ginger (Zingiber officinale) rhizome powder using enzyme-assisted three phase partitioning[J]. Food Chemistry, 2017, 216: 27-36.
文章名称：三相分离法提取胡椒油树脂的工艺研究
