分类：医学论文 时间：2022-03-25 热度：1006
摘 要:细胞基质生物制品大规模生产工艺的选择首要考虑因素是该产品工艺所涉及的生物反应器系统.论文针对动物细胞培养的基本特点,就不同动物细胞生物反应器的结构和原理、优点与缺点、结构优化、传感器最新进展等进行了综述,其目的在于为生物制品研发和生产实际应用中选择更加适合培养工艺的生物反应器,提高动物细胞大规模培养生产生物制品的效率,也为促进新型生物反应器的研究与开发提供一定的参考.
关键词:动物细胞;生物反应器;生物制品
动物细胞生物反应器是模拟动物的体内环境并在体外进行生物培养的系统,它是一个集机械、流体、控制、生物等多学科的高新技术产品.其控制的参数主要有温度、溶解氧(dissolved oxygen,DO)、 pH、流体动力学、营养物质、代谢产物的浓度等[1-3]. 最终目的是为了达到细胞高密度增长,高效地产出具有医药价值的酶、单抗、疫苗等目标产物.相比于传统的生物制品生产工艺,生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷,生物反应器系统具有更好的稳定性和安全性,大量节省劳动力、生产场地和能源消耗,降低生产成本,具有明显优势[4].
研究表明,生物反应器培养过程参数对细胞代谢和病毒滴度具有很大影响[5-8].鉴于不同生物反应器和不同培养方式对生物制品产物质量的影响, 本文从动物细胞生物反应器研究现状、不同类型动物细胞生物反应器的结构和原理以及结构优化等方面做一综述,旨在为生物制品研发和生产实际应用中选择更加适合培养工艺的生物反应器提供一定的参考.
1 动物细胞生物反应器研究现状
欧美一直在生物反应器研究、设计制造、销售领域保持领先地位,并在许多国家及地区设立了生物反应器研发及制造公司.美国 NBS 是世界上专业制造从实验室研发到规模化生产的生物反应器系统的公司之一,生物反应器容量从实验室研发(1.3 L ~40 L)到规模化生产(6 00 L 以上).瑞士的比欧生物工程(Bioengineering AG)公司,在动物细胞培养方面已经为 Novartis(诺华制药)设计制造了 15 立方米的动物细胞培养系统,是目前该领域最大规模的动物细胞培养系统之一.德国贝朗(B.Braun)国际生物工程公司是全球著名的发酵罐专业生产厂商,主要产品包含细胞培养生物反应器及微生物发酵罐[9].
目前,我国大规模动物细胞培养技术还比较落后,缺乏自主知识产权的反应器设计理论研究,尚未达到规模化的生产,主要依赖进口[1 0].因此,生产和制造用于大规模培养细胞的动物细胞生物反应器已成为迫切需要.中国科学院、华东理工大学生物反应器国家重点实验室、哈药集团、上海国强公司、兰州百灵生物技术有限公司等也展开了对动物细胞生物反应器的研究工作,兰州百灵生物技术有限公司已成功研发出 3 L~1 00 L 动物细胞生物反应器且细胞培养效果较优.不同类型动物细胞生物反应器如图 1 所示.
2 不同类型动物细胞生物反应器的结构和原理
根据混合方式的不同分为搅拌式和非搅拌式, 搅拌式生物反应器存在的最大缺点是剪切力造成细胞的损伤,虽然一直在不断改进,但这个问题仍很难避免.相反,非搅拌式反应器产生较小的剪切力并且在动物细胞培养中优势突出.动物细胞生物反应器的基本结构与原理如图 2 所示.
2.1 搅拌式生物反应器
通过搅拌桨旋转以驱动液体流动,从而为液相搅拌提供动力.其结构类似于传统的微生物发酵罐,主要区别在于搅拌器的结构.由于动物细胞没有细胞壁,因此对剪切力非常敏感,为了避免细胞损伤,对搅拌式反应器进行了改进,包括改进搅拌桨、供气方式、加装辅件等,从而进一步优化细胞适宜生长的环境[11].
2.1.1 搅拌器 搅拌器的形式对细胞生长有很大的影响,搅拌桨的选择不仅要求高效的混合特性,还要减小细胞所受的剪切力.这方面改进的主要目的是低剪切力的流场环境中培养细胞.目前,广泛应用的搅拌器类型有螺旋桨叶、Rushton 桨叶和 Elephant Ear 桨叶搅拌器[9].螺旋桨叶以产生轴向流为主的搅拌器.Rushton 桨叶以产生周向流为主, 由于较大的剪切力和较差的混合效果,使用时加装辅件挡板而产生轴向流或加装双层 Rushton 桨叶搅拌器.Elephant Ear 桨叶,属于混合流桨叶,搅拌时能自身产生周向及轴向流场,利于气液、物料的充分溶解和混合且流场剪切力较小.
在搅拌桨的基础上,通过加装辅件等改进,研发了不同类型的搅拌器.在搅拌器的中空轴中产生负压,使培养液从反应器底部吸入、顶部排出;增加旋转过滤器并使用旋转过滤器收集无细胞的培养基.
本文来源于：《动物医学进展》(原名：国外兽医学;畜禽疾病)，1980年创刊，国内外公开发行，面向全国组稿。主要报道国内外动物医学方面先进的理论与技术，基础与临床兼顾，读者对象为全国农业、医学院校师生，科研人员，畜牧兽医人员，包括动物检疫、兽医卫生防疫、动物卫生监督、动物疫病预防控制、畜禽产品检验与监督、兽药监督管理人员，畜禽疾病、宠物疾病、水生动物疾病、野生动物疾病防治人员，实验动物、比较医学等方面的科研人员，以及畜牧兽医行政管理人员。
Kaman 等设计了一个双螺旋带状搅拌桨,在反应器顶部添加 3 块表面挡板,径向的夹角为 3 0°垂直插入液面.挡板的存在减小了液面上的旋涡,不仅实现了较小的流场剪切力,且达到了高密度培养要求.
2.1.2 气泡分布器 气泡分布器的结构形式与培养液中溶解氧效应密切相关.动物细胞培养中常用的气泡分布器可分为 L 型、环形、微孔型.L 型分布器结构简单,加工方便,在容量较小的反应器中使用普遍,由于存在溶氧分布不均的问题,在规模化的反应器中不适用.环形气泡分布器的应用最为广泛, 采用 5 个 ~ 6 个孔口,孔径 0.5 mm ~ 1 mm 之间. 微孔型气泡分布器是美国 Mott 公司研制的一种气体过滤器,其结构是采用特殊金属粉末压制烧结成型,这种结构可以对通过烧结层内部的气泡进行多次破碎,形成雾状的微泡.
在气-液-固的传递过程中,气泡周围的液膜传递阻力阻碍了细胞获得氧能力,此液膜阻力是供氧需要的关键因素.细胞的轻度疏水性促使细胞在气泡上升过程中向气-液界面聚集,并随气泡上升至液面破碎,这个过程会造成细胞严重的损伤;若气泡稳定,会导致气泡周围细胞的营养缺乏.
诸多研究机构通过改善供氧方式来降低动物细胞对剪切力的敏感性.笼式供氧就是气泡被网状物隔开不与细胞直接接触,不仅剪切力小而且混合效果好,更加适宜细胞生长.美国 NBS 公司、华东理工大学生化工程研究所、Lavery、Sucker 等报道了在笼式供氧的基础上进一步减少气泡与细胞直接接触的几率,提高了氧的传递系数[1 2].
2.1.3 供 热 方 式 动 物 细 胞 的 培 养 温 度 通 常 为3 7℃左右,控制误差允许范围在±0.2 5℃.热源主要由生物反应热、搅拌热、散发热和通气热.供热方式有整体壁面供热、底部供热及侧壁供热.一般采用夹套水循环、电磁产热、电热毯的方式控制反应器内的温度.无论用那种方式控制温度,温度的调节一定要逐步攀升,以免温度过高损伤,导致细胞凋亡.
2.2 非搅拌式生物反应器
搅拌式生物反应器存在的最大缺点是剪切力造成细胞的损伤,非搅拌式反应器产生较小的剪切力并且在动物细胞培养中优势突出.
2.2.1 气升式生物反应器 Le Franios 于 1 9 5 6 年率先开发,其原理是采用环流气升式中心进气,无搅拌装置,在传统的鼓泡塔中加入导流筒构成的.其优点是结构简单、操作方便,产生的湍流相对比较温和,剪切力对细胞损伤很小,易实现动物细胞高密度培养.由于气升式反应器放大后,不能确定不受剪切力影响的操作范围,大规模使用较少[1 3].
2.2.2 中空纤维反应器 使用中空纤维膜隔离细胞与培养介质,细胞生长在中空纤维的内壁和外壁. 其原理是模拟毛细血管的结构和功能而设计的[1 4]. 内径约为 200 μm,壁厚为 5 0 μm~70 μm 管壁是多孔膜,O2 和 CO2 等小分子可以自由透过膜扩散,. 其优点是剪切力降低、氧的传递系数增加、营养成分能选择性渗入、高密度培养细胞.但是,其培养环境不均一、产品质量不稳定、不易放大培养,清洗和再利用难度较大[15].
2.2.3 激流式生物反应器 其利用无鼓泡式新型传氧机制,其原理是激流式振荡器机械摇动产生激流而使培养液反复冲刷细胞培养袋内表面的氧分子层,加速氧分子溶解于培养液,以满足细胞正常生长和代谢的需要.其优点是避免了鼓泡和搅拌产生的剪切力、大大提高了氧的传递系数,从而提高了细胞存活率,解决了线性放大培养的问题.相比于罐体式生物反应器,消除了清洗、灭菌等复杂的工艺环节.目前,已被广泛应用于多种动物细胞规模化培养,但其投入成本较大[1 6-1 7].
2.3 新型生物反应器
基于动物细胞培养过程及培养方式的的复杂性,不同类型的生物反应器适合不同种类的动物细胞生长要求.为此,近年来国内外已开发出多种新型生物反应器,新型生物反应器的设计倾向于解决泡沫、剪切力等相关的问题.
2.3.1 填充床生物反应器 在反应器中填充一定材质的介质,用于细胞贴壁生长,细胞直接保留于填充床层,其中片状载体培养的应用较广[1 2,1 8-1 9].通过连续灌注培养基的方式提供充分的营养成分,并带走代谢副产物.同时,细胞截留在反应器中,可以达到很高的细胞密度.其优点是进一步提高细胞产率,并大大降低劳动力的消耗.填充的介质有:带有微孔的陶瓷珠粒、聚氨酯和纤维素泡沫、玻璃纤维、微载体、片状载体等[1 2].根据填充介质的流动形式又将其分为流化床、固定床生物反应器.流化床生物反应器的基本原理是培养液通过通气搅拌垂直向上循环流动,采用一种特殊结构的膜分离系统,确保灌注培养过程中气体的充分交换[2 0].该反应器可无泡通气,具有良好的传质性能和低剪切力.固定床生物反应器是在流化床生物反应器加装固定介质辅件而形成的.最大的缺点是无法直接测定细胞生长密度和活率.但优化了细胞生长与产物合成的培养环境,目前在重组蛋白的表达生产方面应用较广.
2.3.2 脉 动 层 流 式 生 物 反 应 器 由 Thompson 等[2 1]研发,其可产生近似生理的压力波形,通过使用机械呼吸机将脉动层流引入流体柱中,产生与哺乳动物生理学相似的压力波形.将血管结构置于半顺应性管以促进附加的周向拉伸变量作为潜在的信号传导机制.
2.3.3 摇床式生物反应器 摇床式生物反应器的原理是由摇动板替代搅拌桨,培养袋产生波浪提供液相搅拌动力,其优点是适合多种细胞的培养、易线性放大、重组蛋白产量高、节约场地和劳动力等优点.
GE 公司 WAVE 生物反应器应用广泛,其利用一个多层复合壁制成的塑料袋代替了传统发酵罐的不锈钢(或玻璃)罐体,发酵罐体的塑料袋由三层塑料复合而成,被固定在主机的振动平台上,进行“跷板”式往复运动,致使塑料袋内的培养基液体产生类似于 “波 浪”的 周 期 性 运 动,达 到 混 和 均 匀 的 目的[2 2].
2.3.4 空间生物反应器 由于其模拟微重力环境, 因此被称为空间生物反应器.结构由内外两个圆筒组成,外筒固定、内筒旋转,在一定程度上降低了培养物的重力,其优点是无搅拌剪切力,细胞免受机械损伤,细胞处于三维生长环境.空间生物反应器为体外重建人体组织提供了一种新的途径[2 3].
3 传感器最新进展
精确控制是实现产品质量的先决条件,从而更好地了 解 关 键 的 工 艺 参 数 对 生 物 制 品 质 量 的 影响[2 4].例如,细胞培养动力学需要确定活细胞浓度并预测产品的预期水平,更需要确定非活细胞浓度以追踪细胞死亡动力学以此来确定收获时间,这是一个重要的参数,以避免将大量宿主细胞的蛋白和 DNA 释放到生物反应器中,造成下游纯化工艺处理的难度[2 5].近年来,生物反应器在传感器方面有了新的发展,在对现有技术上对某些方面进行了改善, 如精确度、灵敏度、生物相容性、传感器大小等[2 6-2 7].
3.1 胶囊与传感芯片技术
胶囊技术的使用是一个全新的想法,胶囊的工作原理是将多参数传感芯片封装在通常由聚合物制成的生物兼容胶囊壳中,胶囊无线地将信息传送到外部接收器.将许多这样的小装置放在生物反应器中,伴随着叶轮机械力的搅动,它会在整个生物反应器中移动.使得对生物反应器的每一点进行多次不间断测量,准确地测量 pH、溶解氧和温度等关键参数[2 8].
3.2 pH 和 DO 的光学传感技术
光传感器具有成本低、体积小、性能好等特点, 广泛应用于环境监测、生物过程监测、生命科学等领域[2 9].目前使用的许多传感器是过去在大规模生物反应器中使用的传感器,其中一些传感器仍然依赖于早些年代开发的技术,Clark 型 DO 传感器或玻璃 pH 电极应用最为广泛,这种旧的传感器技术是一次性生物反应器的限制因素,因为它们体积大, 易碎.这与一次性生物反应器的性质形成对比,易产生污染源,近年来,由于需要从较小的一次性生物反应器中获得更高滴度,因此更加重视这些问题.
4 展望
细胞培养技术对于生物制药生产具有极其重要的意义,动物细胞用于培养病毒进行疫苗生产被认为是现代疫苗技术的支柱,超过 5 0%的上市治疗性生物制品是在哺乳动物细胞中产生的,动物细胞衍生生物制品在全球制药市场中所占的份额也越来越大[3 0-3 1].
细胞基质生物制品大规模生产所涉及的生物反应器系统是至关重要的,它对工艺产率和性能以及产品的质量有很大影响.例如,涉及到是否能够以高细胞密度生长并且易于扩大培养;是否能实现工艺操作流程简单且批间差异较小;是否能减小设施使用面积和降低污染风险等.
生物制药行业的一个关键是提供全过程分析技术,以促进对哺乳动物细胞培养进行更全面的监测, 并最终实现对产品工艺更好的控制.而目前存在的解决方案是使用电化学或光学传感装置监测关键工艺参数,如 pH、DO、温度和某些代谢成分.目前通常使用的传感器通常是固定在一个位置后,通过一个端口插入传感器进行检测生物反应器培养环境, 这可能导致细胞活力、蛋白表达等发生改变.应用胶囊与传感芯片技术探测生物反应器培养环境,该技术的一个显著优点是胶囊体积小、浮力大、便于实际应用、可以在一个大型反应器中加入多个胶囊,以提高测量的分辨率,并允许更精确的测量[2 8-3 2].
生物反应器为组织工程和再生医学应用提供了大量的前景,它们具有多种用途,包括用于治疗性生产的细胞培养和用于体外器官模型,以提供与常规培养物相比更生理学相关的培养环境[3 3].快速实现悬浮培养技术以及大规模培养技术是生物制药行业发展的制高点.目前我国急需大规模和精细化程度高的动物细胞生物反应器,努力研发势在必行,但成本和扩大规模仍然是主要挑战.理想的生物反应器设计基本上应该考虑几个因素,即可缩放性、精确的传感技术、简单的接种和收获过程、良好的生物相容性、最佳营养物的摄取方式、最小的机械损伤等, 从而最终提高生物制品的质量.
动物细胞生物反应器需要具有低剪切的流场环境、均一的液相搅拌、精确的控制系统、易线性放大培养.生物反应器培养工艺的放大是一个十分复杂的技术问题,设计最大的瓶颈是放大后各参数的精确控制[6-7,1 2],这一难题将被综合性学科解决,涉及流体力学、计算机科学、生物工程等学科.本文对搅拌式、非搅拌式及新型生物反应器做了具体介绍,并对其结构优化等问题进行了探讨,其目的在于研究生物反应器的技术进步,了解目前的状况以及今后的发展,为生物制品研发和生产实际应用中选择更加适合培养工艺的生物反应器和对生物反应器的研究与开发提供一些参考. ——论文作者：李自良1 ,3 ,赵彩红1 ,3 ,王美皓2,3 ,王家敏1 ,3 ,乔自林1 ,2 ,李 倬1 ,2∗
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文章名称：动物细胞生物反应器研究进展
