分类：农业论文 时间：2022-03-25 热度：437
摘 要 应用响应面优化设计法优化固体培养基配方，增大红色诺卡菌的固体培养细胞生物量。首先用 Plackett-Burman 法从现有培养基组分中找到影响红色诺卡菌细胞生物量的关键因素，再通过最陡爬坡法确定细胞生物量最大的配方，用作中心组合设计( Central Composite Design，CCD) 实验的基础起始值，拟合数学模型方程，最后找到最优组分的组合。优化的配方转移至企业实施放大实验，对结果进行验证和比较。试验结果表明，培养基各组分中影响红色诺卡菌细胞生物量的关键因素为蛋白胨、NaCl、牛肉膏; 最优固体培养基配方: 蛋白胨 42 g /L、牛肉膏 8 g /L、NaCl 1. 2 g /L、甘油10 mL/L、Na2HPO4·12H2O 0. 3 g /L、琼脂20 g /L。在细胞生物量方面最优固体培养基配方比原配方高 104% 。响应面优化设计可用于提高红色诺卡菌细胞生物量固体培养基的优化，也为红色诺卡菌培养条件、液体发酵的优化研究提供参考。
关键词 红色诺卡菌; 响应面优化设计法; 中心组合设计; 培养基配方; 细胞生物量
宫颈癌是全球女性中第四大最常见的癌症[1]，也是全球女性癌症相关死亡的主要原因[2]。全世界每年被诊断患有宫颈癌的妇女约有 50 万人，死亡率为 9% ，且在发展中国家宫颈癌的发病率和死亡率仍居高不下[3]。我国每年新增宫颈鳞状细胞癌 13 万例，占全球新诊断病例的 28%[4]。哈拉尔德·楚尔·豪森 1972 年提出人乳头瘤病毒( HPV) 导致宫颈癌，由此获得 2008 年医学诺贝尔奖[5]。临床研究表明，宫颈炎、宫颈癌前病变以及宫颈癌患者发病多与 HPV 的感染有关[6]，机体对 HPV 感染以局部免疫应答为主，其持续感染与免疫应答异常密切相关[7]，在免疫应答过程中，以 γ-干扰素( IFN-γ) 、白细胞介素-4 ( IL-4) 、白细胞介素-21( IL-21) 为代表的细胞因子在细胞免疫、体液免疫和免疫调节中发挥着重要作用[8]。外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架( Nocardia rubra cell wall skeleton，Nr-CWS，国药准字 S20030009) 由红色诺卡菌经过固体扩增发酵收集、细胞破碎、精细提纯、灭菌后获得，再加入辅料冻干等一系列步骤制得成品。主要成分为胞壁酸、阿拉伯半乳聚糖、粘肽( 肽聚糖 PGN) ，可以有效清除 HPV 亚型感染，逆转低度宫颈细胞学异常[9]，并增加转化生长因子-β1 ( TGF-β1 ) 的表达，促进血管生成，促进皮肤创面 愈 合[10]，具有免疫活性强、副 作 用 小 的 特点[11]。已有研究表明，当 HPV 持续感染时，巨噬细胞( M) 及朗格汉斯细胞( LC) 活性低，当外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架介入后，通过模式识别，与 M 和 LC 的相应的表面表达结合，促进 M 和 LC 的活化增殖。同时在非特异性免疫及特异性免疫的作用下清除 HPV 感染[12]。培养基优化的常用方法有单因素和正交试验设计，单因素试验设计只考虑某一因素的影响，正交试验设计只能得到最佳因素水平的组合，都没有研究因子之间的相互作用[13]; 响应面优化设计法是基于正交试验的缺陷而产生[14]，是一种处理复杂关系和优化多种因素的实用统计方法[15]，它能拟合因素与响应间的全局函数关系，有助于快速建模，对函数的响应面和等高线进行分析，缩短优化时间和提高应用可信度[16-17]，与传统优化方法比较，响应面优化设计法更有利[18]。本研究拟采用 Plackett-Burman 法，从原培养基组分中找出对影响红色诺卡菌细胞生物量的主要因素[19]，再通过中心组合设计实验 ( CCD) ，拟合建立描述响应量与自变量关系的多项式回归模型，找到最优配方组合，以优化培养基配方，增加红色诺卡菌的细胞生物量，提高产能，并将其应用于工厂中进行验证评估。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种来源 红色诺卡菌( Nocardia rubra) Nr-8206，由辽宁格瑞仕特生物制药有限公司提供。
1. 1. 2 培养基 ①甘油琼脂培养基( 原固体发酵培养基) : 牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，甘油 10 mL， NaCl 5 g，Na2HPO4·12H2O 0. 3 g，琼脂 20 g，pH 7. 2 ～ 7. 5，蒸馏水 1 000 mL，用于菌株活化和培养; ②肉汤培养基: 甘油琼脂培养基( 原固体发酵培养基) 不加琼脂，用于种子培养。以上培养基均 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min。
1. 1. 3 试剂与仪器 牛肉膏、蛋白胨( 北京奥博星生物技术有限责任公司) ; 甘油、NaCl、Na2HPO4 ·12H2O、琼脂( 国药集团化学试剂有限公司) 。电子天平( 上海海康电子仪器厂) ; LDZX-40SBI 型自动电热压力蒸汽灭菌器( 上海申安医疗器械厂) ; 标准型 PB-10 全自动 pH 计( 德国赛多利斯集团) ; SW-CJ-ZD 型双人单面超净工作台( 苏州净化设备有限公司) ; DGG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海森新试验仪器有限公司) ; 恒温振荡器( 北京凯慕生物技术有限公司) ; TGL-16B 台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) 。
1. 2 方法
1. 2. 1 红色诺卡菌菌种活化 将菌种进行两代活化。将菌体均匀涂布在甘油琼脂培养基的试管斜面培养基表面，33 ℃ 培养4 d后用 1 mL 无菌水冲洗斜面上的菌体，吸出菌悬液转接至装有甘油琼脂培养基的克氏瓶培养基内，再用 2 mL 无菌水冲洗斜面上的残菌并转接至克氏瓶培养基内，L 形棒涂布菌悬液于克氏瓶培养基表面，33 ℃ 培养 4 d。
1. 2. 2 红色诺卡菌的种子液制备 克氏瓶培养结束后，用 15 mL 无菌水冲洗培养基表面的菌体，将菌体接种于肉汤培养基的三角瓶内，33 ℃、150 r/min 培养 4 d，培养结束后离心弃去培养基，加无菌水 800 mL 分散菌体，种子液制备完成，再将种子液轻轻晃动使菌体均匀分散，每个克氏瓶接种 5 mL。
1. 2. 3 Plackett-Burman( PB) 实验 选取基础培养基 组 分 甘 油、牛 肉 膏、蛋 白 胨、Na2HPO4 · 12H2O、NaCl 5 个因素进行考察，每个因素取上限 ( + 1) 、下限( - 1) 两个水平( 表 1) ，以 Nr-8206 的细胞生物量为响应值，得到 5 因素 12 组实验组合 ( 表 2) ，33 ℃培养 5 d 后，将克氏瓶内培养基上的菌苔用无菌水洗下，分别离心弃去上清液，称量菌体重量，得出最终细胞生物量。通过分析实验结果找出影响细胞生物量的影响因素。
1. 2. 4 最陡爬坡实验 将通过 Plackett-Burman 获得的重要因素，以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据因素的效应值大小确定变化步长，逼近最大响应区域。
1. 2. 5 CCD 试验设计和响应曲面分析 以菌株 Nr-8206 的细胞生物量为主要目标，根据最陡爬坡实验结果，进行 CCD 实验，设计 3 个因素及 5 个水平，分别以( - 1. 682、- 1、0、1、1. 682) 编码，如表 3 所示，拟合建立描述响应量与自变量关系的多项式回归模型，找出重要因素的最佳配方水平。
1. 2. 6 培养基优化结果验证 将优化后的培养基配方应用于工厂的生产发酵，进行生产放大实验验证。生产步骤和其后各工艺步骤不变，用以比较细胞生物量。
2 结果与分析
2. 1 Plackett-Burman 实验结果
根据 Plackett-Burman( PB) 实验组合的结果，方差分析见表 4，多元回归方程:
细 胞 生 物 量 ( g /L ) = 10. 36 - 0. 107 5A + 0. 299 2B + 1. 03C - 0. 069 2D - 0. 519 2E
方程中 A、B、C、D、E 为编码值。模型的相关系数 R2 = 0. 867 7，说明回归有效，F = 7. 87，说明模型显著。模型中因素的 P 值越小说明影响越显著，即培养基配方对菌株细胞生物量影响大小排序为蛋白胨( P = 0. 001 7) > NaCl( P = 0. 034 4) > 牛肉膏( P = 0. 167 3) > 甘 油 ( P = 0. 592 9 ) > Na2HPO4·12H2O( P = 0. 728 9) 。后续实验选择蛋白胨、NaCl、牛肉膏作为显著性影响因素。
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方差分析模型的 P = 0. 013 0，证明回归方程是显著的，即模型回归区域拟合较好，模型相关系数 R2 = 0. 867 7，说 明 相 关 性 较 好。调 整 后 R2 = 0. 757 5，说明 75. 75% 实验数据的变异性可用此回归模型来解释。通常变异系数( C. V. ) 越低，则实验的可信度和精确度越高，该 PB 实验的变化系数值 = 6. 37% ，说明可信度和精确度较好。
2. 2 CCD 设计及实验结果
2. 2. 1 最陡爬坡实验结果 将 PB 实验得到的重要因素( 蛋白胨、牛肉膏、NaCl) 的浓度进行最陡爬坡实验。设蛋白胨变化步长为△X1 = 4，NaCl 变化步长为△X2 = 0. 8，牛肉膏变化步长为△X3 = 1，依据 T 值( 表 4) 蛋白胨和牛肉膏为正效应，浓度依次增加; NaCl 为负效应，浓度依次减少逼近最大响应区域，实验设计及结果见表 5。菌株 Nr-8206 的细胞生物量在第 5 组( 蛋白胨、NaCl、牛肉膏的质量浓度分别为 24、0. 8、8 g /L) 水平附近最高，以该组配方值为 CCD 实验起始值进行后续优化。
2. 2. 2 CCD 实验 根据 Design-Expert 软件计算设计 20 组配方组成，实验组及结果见表 6，其中第 1、4、6、11、14、18 组为重复，依据实验结果拟合建立响应量与自变量的多项式回归模型，应用 Design-Expert 软件对实验数据进行回归拟合，得到的回归方程:
菌株 Nr-8206 细 胞 生 物 量 ( g/L) = 14. 110 + 0. 439C +0. 416B - 0. 513E - 0. 525CB + 0. 269CE - 0. 150BE - 0. 322C2 + 0. 081B2 + 0. 421E2 + 0. 006CBE -0. 085C2 B +0. 575C2 E +0. 549CB2
方差分析中( 表 7) ，模型的 P = 0. 022 0，说明该模型显著。失拟项的 P =0. 657 2，模型失拟不显著，所以模型正确，且多元相关系数 R2 = 0. 924 1，说明模型拟合较好。变异系数( C. V. ) 为 3. 66%，说明模型方程可信度、精确度较好。
经 Design-Expert 软件分析，依据回归方程绘制相应的响应面分析图见图 1 ～ 3，因素 NaCl、牛肉膏、蛋白胨和牛肉膏立体分析图走势较陡，表明 NaCl 和牛肉膏交互作用、蛋白胨和牛肉膏交互作用对菌株 Nr-8206 细胞生物量影响显著。
2. 2. 3 最佳培养基配方的验证 为了确定实验结果的可靠性，按最佳优化配方进行企业验证。实验证明，原发酵培养基配方获得的细胞生物量平均为 141. 21 g /批次; 优化后的配方获得的细胞生物量平均为 287. 8 g /批次提高了 104% 。
3 讨 论
对红色诺卡菌培养基配方进行了优化试验，在原培养基组分中，影响细胞生物量的主要因素为蛋白胨、NaCl，其次为牛肉膏，甘油和 Na2HPO4 ·12H2O 影响微弱。通过响应面优化设计法获得的最佳固体培养基配方为蛋白胨 42 g /L、牛肉膏 8 g /L、NaCl 1. 2 g /L、甘油 10 mL /L、Na2HPO4 · 12H2O 0. 3 g /L、琼脂 20 g /L; 经过 CCD 实验，优化配方的细胞生物量为 16. 075 g /L，原始配方的细胞生物量为 4. 85 g /L，优化配方的细胞生物量比原始配方的细胞生物量高 231% 。在工厂验证中，采用优化配方培养菌株 Nr-8206 的平均细胞生物量达 287. 8 g /批次，比原配方的平均细胞生物量( 141. 21 g /批次) 高 104% 。企业生产的外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架为 HPV 感染的真正的对症治疗药品，其固体发酵周期长、工作量大。优化后的配方使红色诺卡菌固体发酵的细胞生物量提高了 104% ，解决了目前固体发酵产能低的短板，提高企业的经济效益和减少员工的工作强度作用明显。经过固体培养基配方的优化实验，证明响应面优化设计应用在提高红色诺卡菌固体发酵培养基优化方面是可行的，为红色诺卡菌培养条件的优化、液体发酵的优化研究提供依据。——论文作者：王 琳1，2 ，章朦玥1 ，薛金艳1 ，南 宁1，2 ，王 丹1，2 ，张怡轩1*
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文章名称：红色诺卡菌固体培养基配方的优化
