分类：电子论文 时间：2022-04-27 热度：695
摘 要: 全细胞生物传感器是一种以微生物全细胞为敏感元件，可以快速感应环境中的毒性物质及污染物的装置。因其具有响应快、体积小、成本低、可实现原位监测等优势，在环境监测、药品研发、食品工业等领域显示出巨大潜力。综述了全细胞生物传感器的原理、分类及其在环境污染物监测领域的应用进展等，并对其未来的发展趋势进行了展望，以期为全细胞生物传感器的开发与利用提供参考。
关键词: 全细胞生物传感器; 环境污染物监测; 固定化
全细胞生物传感器是以微生物全细胞作为分子识别敏感元件，感应环境中的毒性物质及污染物的装置[1]。其由单一微生物的检测方法到结合合成生物学、微生物学、生态学和工程学等形成的交叉学科经历了近 30 年的发展[2]。该类传感器以活细胞作为感应中心，当有目标毒性物质存在时，会诱导报告基因( 如绿色荧光蛋白基因、萤光素酶基因等) 表达，并产生可测量的信号，从而达到检测环境中毒性物质的目的[3]。而其具有的响应快、成本低、操作简单、无需样品预处理等优势，使检测仪器的微型化、自动化和连续在线监测成为可能。发展至今，全细胞生物传感器一直是生物学、环境科学等领域的研究热点。全细胞生物传感器目前主要用于检测环境中的毒性物质及动物源食品中的抗生素残留[4]。在此，本文主要对全细胞生物传感器的原理、分类进行综述，并简述其在环境监测中的研究进展，以期为今后全细胞生物传感器的开发与利用提供参考。
1 全细胞生物传感器
1982 年 Quillardet 等[2] 进行的 SOS 显色试验，是第一个研究微生物报告基因的试验，开创了全细胞生物传感器的先河。随着科学技术的迅猛发展，全细胞生物传感器以其独特的优势，显示出巨大的发展潜力[3]。
1.1 全细胞生物传感器的原理
全细胞生物传感器以细菌为指示生物，利用一种或多种感应和报告基因来产生出一种可识别并且可量化的产物[4]( 目前主要为荧光素酶) ，具体如表 1 所示。其主要由 2 个部分组成: 感应元件和报告元件( 图 1) 。第一部分调节基因或启动子能够对检测的物质或其浓度的变化做出响应，第二部分能够将检测到的化学信号转换成可检测的报告蛋白信号[12]，进而以报告蛋白的数量和活性作为细胞对靶目标物的感应指示。理想的报告蛋白应具有高敏感性、易检测、可定量的特点，且不会出现在原始菌种中[13]。全细胞微生物传感器主要是为了检测化学物质和样品的毒性，但研究表 明，生 物 传 感 器 还 有 在 其 他 领 域 应 用的可能性，如将不同的元件整合到生物传感器上，当信号输出的时候能够保证它是一个连续的反应，就 可 以 检 测 细 胞 中 积 累 的 化 合 物 的 数量[14]。这种系统不仅能够检测化合物的浓度，还可以计算事件的数量。
1.2 全细胞生物传感器的特点
全细胞生物传感器以活细胞作为感应元件，通常无需对样品进行预处理，因而比传统的检测仪器更易携带，同时由于细胞繁殖速度快，其成本也更低[15]。此外，由于细胞响应快、体积小，还可实现采样点的原位检测和实时监测[16]。另一方面，细胞内表达调控的变化是由对检测物的感应引起的，因此，全细胞生物传感器还可分析待测物质是否可在生物体内代谢与利用等信息[17]。全细胞生物传感器所用细菌主要分为 2 种: ①对有毒物质敏感的天然发光菌株，如荧光假单胞菌，从 20 世纪 80 年代就开始了对该类菌株发光能力的检测实验，当这类细菌感应到有毒物质后，它发出的荧光就会有所变化，因此可利用这些天然生物荧光来评估样品的毒性。这种检测充分利用了生物发光需要能量和辅因子的特点，任何一个微小的荧光变化都预示着细胞正暴露在毒性环境中，使得检测更加灵敏[18]。②导入报告基因( 如绿色荧光蛋白基因) 及含有受有毒物质诱导的启动子和相关调节基因的基因工程菌株( 通常以大肠杆菌为宿主进行改造) ，基因工程手段的应用使全细胞生物传感器的类型更为多样化，并具有更多的可能[19]。
2 全细胞生物传感器的种类
根据所检测的物质及启动子类型的不同，全细胞生物传感器主要分为 2 类: 非特异性全细胞生物传感器( 组成型) 和特异性全细胞生物传感器( 诱导型) [20]。特异性全细胞生物传感器中根据检测物质的不同又可细分为毒性或压力应答生物传感器、金属离子生物传感器、特定化合物生物传感器[21]。
2.1 非特异性全细胞生物传感器
非特异性生物传感器主要检测环境中的总有毒物质，无法具体到某一特定物质。在无毒性物质存在的条件下，报告基因能够连续表达并产生信号，一旦有毒性物质存在，细胞的生长受到抑制，信号减弱，从而达到测定总毒性物质的效应。但由于测定环境的复杂性，细胞易受到外界因素的影响，因此会出现假阳性的结果[22]。
2.2 特异性全细胞生物传感器
特异性全细胞生物传感器为诱导型的传感器，即在某一种或某一类化合物( 如重金属、抗生素) 的诱导下，启动子被激活并使偶联的报告基因表达。可将其细分为毒性或压力应答生物传感器、金属离子生物传感器、特定化合物生物传感器。
2.2.1 毒性或压力应答生物传感器 毒性或压力应答生物传感器主要用于检测某一类毒性物质或胁迫压力 ( 如 DNA 损伤、蛋白质损伤、膜损伤) [23，24]，在毒性物质的刺激下，参与压力反应的启动子被激活，进而使报告基因表达。一般选择来自压力应答网络中的一个关键启动子与不含启动子的报告基因融合，然后转入宿主细胞。其中应用最为广泛的是重组修复蛋白 A( RecA) -LexA调节的 SOS 压力应答系统，它检测的是由化学物质所诱导的 DNA 损伤[25]。大肠杆菌和鼠沙门伤寒菌的 SOS 响应网络中有几十个基因，其中部分基因已经成功地运用到毒性诱导报告基因表达中，如 umuC、recN、sfiA、recA 和 cad [26，27]。除了这些基因，全基因组筛选策略也逐渐被应用到筛选可用于此类传感器的启动子，如利用鸟枪法随机筛选大肠杆菌染色体文库的 1.8 kb 片段，将筛选到的片段与发光杆菌 luxCDABE 荧光素酶报告基因进行融合，最终用于标准压力源的响应及筛选[28]。此外，目前还有研究表明，将细胞暴露在压力条件下，进行全基因组转录组分析，有助于筛选出新的用于毒性物质感应的启动子[29]。
2.2.2 金属或类金属传感器 金属传感器一般由对某种或几种重金属离子敏感的操纵元件和报告单元 2 个部分组成，能够对特定的重金属离子进行响应。其中，汞和砷的感应报告菌株最先被开发出来[30]。汞传感器由典型的大肠杆菌 Tn21 转座子的 mer 操纵子( merTPCADE) 、调节蛋白 MerR 连同 1 个 merR-merT 基因间的 DNA( 包括 merRp 和汞诱导的 merTp30) 组成。这个内源性的 MerR-merTp 系统对汞具有高敏感性，检测浓度最低可达 1 fM[31]。而砷传感器采用的是天然细菌对抗亚砷酸盐和砷酸盐的防御系统。大多数砷传感器都包括起源于大肠杆菌质粒 R773 和葡萄球菌质粒 pI258 的 Ars 操纵子，其具体由用于检测砷酸盐的转录抑制子 ArsR 和受砷酸盐自动调节的去阻遏的 arsRp 组成。但是，传感器自身报告基因本底水平表达较高，这是由于它所采用的 ArsR-arsRp 通 路 具 有 可 自 动 调 节 的 ArsR[32]。 Wackwitz 等[33]通过在 arsR 基因的下游及报告基因的上游加入包含 ArsR 结合位点的第二个 DNA 片段，并对 lacZ 报告子的上游的核糖体结合位点进行一系列的修饰，在砷酸盐不存在的情况下，获得了低水平表达的报告基因。
2.2.3 特定化合物生物传感器 特定化合物一般包括无机物和有机物，其中靶向无机物的检测通常是依赖于对其的直接响应，无需某些中间产物的参与; 而靶向有机物的检测则是依赖于细胞分解代谢中调节蛋白和代谢化合物之间的相互作用。这种传感器的组分都是从对特定的物质( 如有机物、抗生素等) 表现出抗性机制的细菌中分离的，或者从一些能够代谢毒性化合物( 如萘、甲苯、苯酚) 的菌株中分离得到的( 表 2) 。如荧光假单胞杆菌萘传感器中的 NahR 感应蛋白，就是来源于细菌中的 LysR-类型转录激活因子家族，它是原始荧光假单胞杆菌萘传感器的延伸，靶向于单一的化合物或者一类化合物。实际上它的效应化合物激活的调节蛋白并不是靶向化合物萘，而是在产生靶向物的代谢途径中的中间产物水杨酸盐[46]。另外一种应用较广泛的调节蛋白是 XylRDmpR、NtrC 转录激活子的亚家族[47]，它们是多结构域蛋白，当被效应物激活后，就能够诱导依赖于RNA 聚合酶 σ 因子的启动子表达。
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虽然可开发为信号通路的天然调节蛋白的种类较多，但由于它们的专一性并不足以检测优先污染物( 一般指具有较强毒害性的物质) 。在这 种情况下，就会根据特定的靶向有机物，利用突变和合成生物学方法设计产生所需的检测特异性。如 XylR 突变体用于感应爆炸蒸气中的二硝基甲苯( dinitrotoluene，DNT) ，DmpR 突变体用于感应 2，4-二氯苯酚，HbpR 突变体通过识别 2-氯联苯来检测多氯联苯[48～ 50]。此外，DntR 突变体能够识别硝基甲苯、硝基苯甲酸盐和苯酸盐，也是通过定点突变实现的[51]。
3 全细胞生物传感器在环境污染物监测领域的应用
全细胞生物传感器可应用于环境污染物和动物源食品中抗生素残留的监测、细胞坏死与凋亡的检测、药物研发、营养流行病学的研究等领域[52～ 54]，但其在环境污染物监测领域中的应用最为广 泛[55]。随 着 基 因 工 程 技 术 的 出 现，采 用 DNA 重组技术对其进行改造而构建基因工程菌株的研究策略应用最多。Willardson 等[56]最初采用 DNA 重组技术将 XylR 启动子与荧光素酶基因进行融合，并导入到大肠杆菌中用于检测污水及土壤样本中的甲苯。而 Kim 等[42] 构建的含有 CadC 启动子的重组质粒能够检测样本中重金属 Cd2+ 、Pb2+ 、Zn2+ 的含量。此外，在表 2 中也列举了一些用于环境污染物检测的全细胞生物传感器，如甲苯、二甲苯、乙苯( 通过 XylR 或 TbuT 检测) 、苯酚( DmpR 检测) 、羟化联苯( HbpR 检测) 和菲 ( PhnR 检测) 等。而在动物源食品中抗生素残留检测方面，Cheng 等[57]筛选到 1 株对氟喹诺酮类药物敏感的菌株 E. coli pK12，并建立了检测肉蛋奶中 11 种氟喹诺酮类药物的方法，具有高回收率、高敏感性等特点。
通常研究构建的报告菌株在实验条件下都具有良好的检测效果，但若将其应用于野外环境中污染物的检测则必须考虑将全细胞束缚住，因此，必须将全细胞固定在某种介质上，这样既可保持微生物的活性，也能将信号进行转换并放大。常用的固定方法有: 利用琼脂将微生物固定在微孔板的底部或将菌株包膜在硅凝胶中; 通过硅藻土将微生物连接在光纤的末端[58]; 利用纳米技术进行细胞的固定[59，60]。如 Mbeunkui 等[61]将发光的大肠杆菌和酿酒酵母分别定植于高密度的微孔矩阵中，并采用相应的可视化解码系统，实现了不同细胞信号的测定。而 Salalha 等[62]利用纳米技术将聚乙烯醇的液滴拉伸成非常细的纳米纤维，对细胞进行固定。
细胞实现固定化后，则需考虑将产生的信号进行放大，而生物芯片技术是一项集生物、化学、物理、光学和微电子信息技术的综合高新技术，它的出现使全细胞生物传感器实现微型化和高通量化的目标不再遥远。2002 年 Bolton 等[63]构建了第一个全细胞生物传感器芯片，他们利用互补性金属氧化半导体构建了报告菌株的光信号整合回路系统，用以检测经水杨酸或萘诱导后报告菌株所产生的低水平光信号。因此，将报告菌株与生物芯片结合必将在后基因组时代的科学研究中发挥巨大作用。
同时，微生物电催化也是一个比较新的领域，其以微生物细胞内的代谢作为催化剂，结合电极共同完成信号的转变，将全细胞与电化学的优势进行了充分结合[64，65]。如希瓦氏菌属中的 Shewanella oneidensis MR-1 可代谢多种电子受体，如甲苯、三氯乙酸、顺丁烯二酸等环境污染物，因而，其在环境修复领域呈现出巨大潜力[66，67]。2017 年 Si 等[68]以 Shewanella oneidensis MR-1 为识别元件，将电化学电极作为信号转换元件制造出了全细胞电化学生物传感器，用于测定水中的 3，5- 二氯酚，使得下游信号的检测灵敏度得到提高并极大地降低了成本。
4 展望
全细胞生物传感器发展至今，研究热度持续增高。目前研究重点仍是报告菌株的优化与改良，主要有以下几个方向: ①寻找对检测物质特异性较强及较敏感的调控元件[69]; ②寻找易检测且稳定的报告基因[70]; ③由于污染日趋严重、污染类型增多，构建的基因工程报告菌株应具有更强的抗性及更高的广谱性[71]; ④选择合适的介质使微生物能够在较长时间内保持活性。
因此，尽管对全细胞生物传感器的研究已有几十年，但是在生物传感器菌株的构建及其检测性能方面还有较大的提升空间。除了技术上的阻碍，由于所研究菌株为转基因菌株，还存在明显的监管问题，这就意味着它们的应用只能限制在实验室或特定环境中。因此，克服监管障碍等问题，以及获得国际的认可十分必要。——论文作者：秦伟彤， 田 健， 伍宁丰*
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