分类：SCI论文发表 时间：2025-05-28 热度：444
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期刊ISSN：0194-911X
主编：Rhian M. Touyz教授，MBBCh，PhD，FRCP，FRSE，FMedSci
执行编辑：Trudie Meyer
助理执行编辑：Renata Gil
编辑助手：Emily LeGrande
出版频率：月刊
读者群体：临床和学术心脏病专家、内分泌学家、肾脏病学家、内科医生/初级保健医师、生理学家、药理学家和分子生物学家
每年页数：2800页
审稿流程：同行评审
稿件接受率：12.5%
原创研究文章的周期：提交至首次决定：2周;接受至提前在线发布：3.5周;接受至印刷出版：7周
期刊官网：https://www.ahajournals.org/journal/hyp
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论文标题为：ca-circSCN8A Promotes HPASMCs Ferroptosis via LLPS Initiated R-Loop
摘要
背景(Background)
铁死亡(ferroptosis)已被证实在肺动脉高压(PH)中发挥作用，而染色质相关RNA(chromatin-associated RNAs)也日益被认为是该过程中的关键调控因子。然而，其具体的分子机制尚未明确。
方法(Methods)
本研究通过生物信息学分析、Sanger测序及RNase R消化等方法，确认PH中ca-circSCN8A表达上调。采用功能获得与敲除实验，探究ca-circSCN8A在低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞及小鼠PH模型中氧化还原相关铁死亡中的作用。通过RNA免疫共沉淀(RIP)和RNA pull-down实验检测ca-circSCN8A与FUS的相互作用。结合FRAP(荧光恢复)、ChIRP-qPCR、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)等实验手段，进一步解析其分子机制。
结果(Results)
ca-circSCN8A在PH中表达上调。其过表达可促进人肺动脉平滑肌细胞中低氧诱导的铁死亡。在低氧条件下，ca-circSCN8A可招募EP300，促进FUS的乳酰化修饰，进而通过液-液相分离(LLPS)机制形成ca-circSCN8A/FUS/EP300复合物。该相分离过程可稳定由ca-circSCN8A与铁死亡相关基因SLC7A11启动子形成的R-loop，从而抑制SLC7A11的转录，打破氧化还原稳态，诱导铁死亡。
结论(Conclusions)
ca-circSCN8A通过招募EP300促进FUS乳酰化，并驱动与FUS和EP300形成液-液相分离介导的复合物。此过程促使ca-circSCN8A与非宿主基因SLC7A11启动子形成R-loop，参与调控低氧条件下的人肺动脉平滑肌细胞铁死亡过程。本研究首次证实circRNA可通过液-液相分离方式与非宿主基因形成R-loop，为肺动脉高压提供了新的铁死亡调控机制和潜在治疗靶点。
研究结果
图1. 缺氧对ca-circSCN8A表达及其亚细胞定位的影响。
A：使用外向引物和内向引物的RT-qPCR产物，显示出ca-circSCN8A的环化(cDNA，gDNA[基因组DNA];n=6)。
B：ca-circSCN8A在人肺动脉内皮细胞(HPAECs)和人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)中的表达(n=6)。
C：缺氧处理的HPASMCs在不同时间点的ca-circSCN8A表达水平(n=6)。
D：RNA原位杂交(FISH)检测HPASMCs在常氧(Nor)和缺氧(Hyp)条件下(24小时)ca-circSCN8A的表达和亚细胞定位。红色为ca-circSCN8A，蓝色为DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，标记细胞核)。比例尺=50 µm。
E：ca-circSCN8A在心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中的表达情况(n=6)。
F：FISH显示ca-circSCN8A在肺组织中的分布。比例尺=100 µm。
数据以均值 ± 标准差(SD)表示。统计分析采用单因素方差分析(1-way ANOVA)后接 Bonferroni 校正，及两组数据间的 Student t 检验。
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。NC 表示阴性对照。
图2. 缺氧(Hyp)通过ca-circSCN8A促进肺血管重构与铁死亡。
A：SuHX-PH(缺氧 + sugen5416 诱导的肺动脉高压)小鼠模型的右心室收缩压(RVSP)及右心室(RV)与左心室+室间隔(LV+S)重量比值(n=6)。
B：接受AAV9-ca-circSCN8A处理小鼠的肺动脉血流速度积分(PAVTI)和肺动脉加速时间(PAAT)(n=6)。
C：采用苏木精-伊红(HE)染色和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫染色对肺动脉形态进行分析(n=6)。比例尺=200 µm。所有数值以平均值 ± 标准误(SEM)表示(n=6)。
D：ca-circSCN8A对丙二醛(MDA)、亚铁离子(Fe²⁺)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)表达水平的影响(n=6)。
E：免疫印迹(WB)结果显示ca-circSCN8A对人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)中铁死亡相关蛋白ACSL4(长链酰基辅酶A合成酶家族4)、SLC7A11(溶质载体家族7成员11)和GPX4(谷胱甘肽过氧化物酶4)表达的调控作用(n=6)。
NC 表示阴性对照;Nor 表示常氧条件。
图3. ca-circSCN8A通过与SLC7A11启动子形成R-loop介导人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)的铁死亡。
A：SLC7A11 mRNA 的表达水平。
B：丙二醛(MDA)、亚铁离子(Fe²⁺)、还原型谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽(GSSG)的表达水平(n=6)。
C：免疫印迹(WB)结果显示铁死亡标志蛋白 ACSL4(长链酰基辅酶A合成酶家族4)和 GPX4(谷胱甘肽过氧化物酶4)的表达(n=6)。
D：常氧与缺氧条件下HPASMCs中R-loop的免疫荧光图像，以及转染RNase H1后的SLC7A11 mRNA表达(n=6)。
E：ChIRP-qPCR结果验证了ca-circSCN8A启动子与SLC7A11启动子之间形成R-loop的存在(n=6)。
F：在常氧、缺氧以及site 1突变质粒处理条件下HPASMCs中SLC7A11、ACSL4和GPX4的表达情况(n=6)。
DAPI 表示 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(细胞核染料);Hyp 表示缺氧;NC 表示阴性对照;Nor 表示常氧。
图4. SLC7A11(溶质载体家族7成员11)表达受ca-circSCN8A及其下游DNA/RNA结合蛋白FUS的调控。
A：通过ca-circSCN8A pull-down实验鉴定蛋白复合物，并通过免疫印迹(WB)分析FUS的结合情况(n=3)。FUS分子量：70 kDa。
B：通过RNA免疫共沉淀(RIP)确定FUS与ca-circSCN8A表达的相关性(n=3)。
C：通过RNA原位杂交与免疫荧光联合实验(FISH-IF)验证ca-circSCN8A(红色)与FUS(绿色)在细胞核内的共定位。比例尺=50 µm。
D：转染si-FUS-181后，通过WB和qRT-PCR检测SLC7A11蛋白和mRNA的表达水平(n=6)。
E：在人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)中，分别转染ASO-ca-circSCN8A和si-FUS-181后R-loop的免疫荧光图像。
F：在缺氧与常氧条件下，通过相关试剂盒测定HPASMCs中Fe²⁺、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽(GSSG)的表达水平(n=6)。
所有数据均以平均值±标准误(SEM)表示。
ASO 表示反义寡核苷酸;Hyp 表示缺氧;Nor 表示常氧。
图5. 由ca-circSCN8A与FUS及SLC7A11启动子R-loop形成的液-液相分离结构可抑制SLC7A11的表达与铁死亡。
A：将与 FUS 融合的 GFP(绿色荧光蛋白)表达载体和与 ca-circSCN8A 融合的 mCherry 表达载体共转染至活细胞中，通过共聚焦显微镜观察细胞核中聚集体的形成与分布。比例尺 = 100 µm。
B：进行液滴融合实验，并采用光漂白后荧光恢复(FRAP)实验评估其动态特性。
C：通过RT-qPCR和免疫印迹(WB)分别检测SLC7A11的mRNA和蛋白表达水平(n=6);同时通过WB检测铁死亡标志蛋白ACSL4(长链酰基辅酶A合成酶家族4)和GPX4(谷胱甘肽过氧化物酶4)的表达水平。
D：通过免疫沉淀-免疫印迹(IP-IB)检测常氧与缺氧条件下FUS介导的R-loop形成水平(n=3)。FUS分子量：70 kDa。
E：在FUS内源性敲除的HPASMCs中，通过dot blot检测常氧和缺氧条件下的R-loop形成情况，并检测SLC7A11 mRNA的表达水平。
F：在常氧、缺氧和缺氧+1,6-己二醇(1,6-HD)处理条件下，通过dot blot检测R-loop表达;在FUS内源性敲除的HPASMCs中以及在缺氧条件下不同浓度1,6-HD处理下，使用qRT-PCR检测SLC7A11 mRNA表达水平(n=6)。
图6. 由ca-circSCN8A与FUS形成的液-液相分离(LLPS)结构受乳酸化修饰酶EP300的调控。
A：通过共免疫沉淀(Co-IP)实验验证 FUS 与 EP300 之间的相互作用(n=3)。EP300 分子量为 265 kDa。
B：使用乳酸检测试剂盒测定常氧、缺氧及缺氧+si-EP300 处理的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)中乳酸的表达水平(n=3);并通过免疫沉淀和免疫印迹(IP-WB)检测常氧、缺氧及缺氧条件下si-EP300的表达及FUS的乳酸化水平。
C：使用免疫印迹(WB)检测EP300抑制剂 C646 对 SLC7A11(溶质载体家族7成员11)表达的影响(n=6);并进行液滴融合实验以评估LLPS状态。
D：通过相关试剂盒测定 C646 处理对 HPASMCs 中铁死亡相关指标 Fe²⁺、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽(GSSG)表达水平的影响(n=6)。
E：通过光漂白恢复实验和液滴融合实验验证EP300介导的LLPS能力。
F：采用共聚焦显微镜观察 circSCN8A、FUS 与 EP300 在细胞核内形成 LLPS 凝聚体的过程，以及 C646 对此类核内凝聚体形成的影响。结论及展望本研究首次揭示：ca-circSCN8A 可以通过形成与非宿主基因 SLC7A11 启动子的 R-loop，在 FUS 介导的液-液相分离(LLPS)作用下，促进缺氧状态下人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)的铁死亡(ferroptosis)。这一机制打破了“circRNA 仅调控宿主基因表达”的传统认知，提出了 circRNA 可通过相分离核凝聚体调控非宿主基因转录的新模式。
此外，研究还发现：
ca-circSCN8A 可募集 EP300;
诱导 FUS 的乳酸化修饰(lactylation);
进而驱动 LLPS，形成调控铁死亡的多分子复合物。
这一发现不仅扩展了铁死亡调控的分子机制，更提示非组蛋白的翻译后修饰在LLPS调控中可能具有核心作用。
作者提出：未来研究应探索是否存在更多类似的 circRNA–R-loop 调控路径，并评估靶向 LLPS 或 circRNA–R-loop 相互作用是否具备治疗潜力，尤其是在肺动脉高压(PH)及其他铁死亡相关疾病中。
高分辨成像与体内动物模型将是下一步验证这一机制生理意义的关键工具。
