分类：农业论文 时间：2021-09-27 热度：190
摘要目的:建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定中成药如意金黄散中12种化学成分的含量。方法:采用C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，流动相A为水(含0.1%甲酸)，B为甲醇(含0.1%甲酸)，梯度洗脱，流速为0.3ml·min-1，柱温为45℃;采用电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)模式，正负离子检测。结果:大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、姜黄素、小檗碱、黄柏碱、厚朴酚、橙皮苷、甘草苷和甘草酸的线性范围分别为8.64～864ng·ml-1、11.02～1102ng·ml-1、10.68～1068ng·ml-1、10.78～1078ng·ml-1、11.12～1112ng·ml-1、12.42～1242ng·ml-1、11.88～1188ng·ml-1、9.47～947ng·ml-1、9.32～932ng·ml-1、13.50～1350ng·ml-1、11.72～1172ng·ml-1和10.52～1052ng·ml-1，各成分在线性范围内具有良好的线性关系(r>0.99);加样回收率均在96.5%～104.3%范围内，RSD小于4.4%(n=9)。3批如意金黄散中大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、姜黄素、小檗碱、黄柏碱、厚朴酚、橙皮苷、甘草酸和甘草苷的含量测定均值分别为0.7630，0.4660，0.8750，0.3290，0.2340，1.8140，4.3960，1.7000，3.5160，2.0850，0.7630，0.9480mg·g-1。结论:研究结果表明，该方法简单、快速、灵敏、准确，可以用于如意金黄散中多种成分的含量测定。
关键词如意金黄散;含量测定;超高效液相色谱-串联质谱法
如意金黄散是中药复方制剂，最早出自明代陈实功所著《外科正宗》[1]，也是中国药典2020年版一部的收录药品[2]。如意金黄散处方由天花粉、黄柏、大黄、姜黄、白芷、生天南星、厚朴、陈皮、苍术、甘草等10味中药组成，具有清热解毒、消肿止痛作用，主要用于热毒瘀滞肌肤所致疮疡肿痛、丹毒流注，症见肌肤红、肿、热、痛，亦可用于跌打损伤[3]。目前临床中主要采用外用给药方式，用于静脉炎、痛风性关节炎、骨折或软组织损伤、带状疱疹及其他皮肤性疾病[4～7]。目前，如意金黄散含量测定方法均采用HPLC法[8～11]，结果表明不同厂家如意金黄散指标成分含量差异显著。中国药典2020年版将该品种定量指标增加至姜黄素、小檗碱、大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素和大黄素甲醚等7种，随着检测成分增加，HPLC法测定时所需的条件和时间也会相应增加。超高效液相色谱-质谱联用(UPLCMS)法较HPLC法具有更高的灵敏度和检测效率，在中药材的质量控制中的应用也越来越多。因此本文在中国药典2020年版基础上，采用UPLC-MS法同时测定如意金黄散中12种成分，为如意金黄散的质量控制研究提供依据，报道如下。
1仪器与试药
美国Waters公司超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪，配ACQUITYUPLC超高效液相色谱仪、XEVOTQ串联四极杆质谱仪、电喷雾离子化源(ESI)、Masslynx4.1数据处理系统;AUW120D分析天平(日本SHIMADZU公司，感量:0.01mg);VORTEX-6涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);KM-340超声清洗机(广东科盟电器有限公司，可调功率:40kHz)冷冻高速离心机(5427R，eppendorf公司)。
对照品:大黄素(批号:110756-201711，纯度99.5%)、大黄酸(批号:110757-201607，纯度99.3%)、大黄酚(批号:110796-201616，纯度99.6%)、大黄素甲醚(批号:110758-201616，纯度99.0%)、芦荟大黄素(批号:110795-201710，纯度98.3%)、甘草酸铵(批号:110731-201418，纯度93.1%)、甘草苷(批号:111610-201004，纯度18.7%)、盐酸小檗碱(批号:110713-200609，纯度100%)、黄柏碱(批号:111895201504，纯度94.9%)、厚朴酚(批号:110729-200412，纯度100%)、姜黄素(批号:110823-201004，纯度98.8%)、橙皮苷(批号:110721-200613，纯度99.0%)均购自中国食品药品检定研究院;甲醇(HPLC级)购自于德国Merck试剂公司，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。
2方法与结果
2.1色谱和质谱条件
2.1.1色谱条件色谱柱:WatersAcquifyBEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm);流动相:A为水(含0.1%甲酸)，B为甲醇(0.1%甲酸)，梯度洗脱(0～0.3min，10%B;0.3～0.8min，10%～55%B;0.8～3.5min，55%～90%B;3.5～5.0min，90%B;5.0～5.5min，90%～10%B;5.5～6.0min，10%B);流速:0.3ml·min-1，柱温为45℃;进样体积5μl。
2.1.2质谱条件采用电喷雾离子源(ESI)，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气体流速为800L·h-1，毛细管电压为3.0kV，选择正负离子扫描方式，多反应监测(MRM)模式，化合物质谱参数见表1，各化合物提取离子流图谱见图1。
2.2如意金黄散的制备
处方:天花粉320g、大黄160g、姜黄160g、黄柏160g、白芷160g、天南星64g、厚朴64g、陈皮64g、苍术64g、甘草64g，按中国药典2020年版制备方法进行制备。
2.3溶液的制备
2.3.1对照品溶液精密称取各对照品适量，置于10ml量瓶中，加甲醇后超声溶解并定容至刻度(必要时加热溶解)，摇匀得浓度约为1mg·ml-1的对照品储备液，其中大黄素为0.8640mg·ml-1、大黄酸为1.1020mg·ml-1、大黄酚为1.0680mg·ml-1、大黄素甲醚为1.0780mg·ml-1、芦荟大黄素为1.1120mg·ml-1、姜黄素为1.2420mg·ml-1、小檗碱为1.1880mg·ml-1、黄柏碱为0.9475mg·ml-1、厚朴酚为0.9320mg·ml-1、橙皮苷为1.3500mg·ml-1、甘草苷为1.1720mg·ml-1以及甘草酸为1.0520mg·ml-1。分别精密量取各对照品储备液2ml，置于50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀制得浓度约为40μg·ml-1的混合对照品溶液。
2.3.2供试品溶液精密取如意金黄散0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-70%甲醇溶液(1∶100)50ml，放置0.5h，称定质量，超声(300W，40kHz)处理40min，放冷，再称定质量，用盐酸-70%甲醇溶液(1∶100)补足减失质量，摇匀，过滤，取续滤液1ml，用甲醇定容于50ml量瓶中，即得供试品溶液。
2.4线性关系考察
取“2.3.1”项下混合对照品溶液用初始流动相溶液(0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸甲醇=90∶10，v/v)稀释成浓度约为10，20，50，100，200，500，1000ng·ml-1的对照品梯度溶液，按照“2.1”项下条件进行测定。以对照品质量浓度(X，ng·ml-1)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，作加权线性回归计算。结果表明，各成分在相应的线性范围内线性关系良好。将混合对照品溶液逐级稀释，以S/N≥10时的浓度为检测限(LOQ)，S/N≥3时的浓度为检测限(LOD)，结果见表2。
2.5精密度试验
取混合对照品溶液(浓度约500ng·ml-1)，按照“2.1”项下检测条件连续进样6次，试验结果表明，大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、姜黄素、小檗碱、黄柏碱、厚朴酚、橙皮苷、甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为1.78%，0.98%，1.56%，1.87%，1.39%，1.73%，1.46%，1.03%，1.59%，2.01%，1.57%和2.01%(n=6)，表明仪器精密度良好。
2.6稳定性试验
取同一供试品溶液，按照“2.1”项下条件分别于0，2，4，8，12，24h时进样分析，计算24h内各成分峰面积的RSD。结果表明，12种化合物峰面积RSD分别为1.54%，1.03%，1.89%，2.11%，1.89%，1.34%，2.07%，1.23%，2.03%，2.01%，0.89%和2.01%(n=6)，表明各成分在24h内稳定性良好。
2.7重复性试验
取1号样品粉末，按“2.3.2”项下方法制备6份样品溶液，按照“2.1”项下条件进行测定。结果显示，各成分含量均值为:大黄素0.7680mg·g-1、大黄酸0.4700mg·g-1、大黄酚0.8790mg·g-1、大黄素甲醚0.3320mg·g-1、芦荟大黄素0.2390mg·g-1、姜黄素1.8110mg·g-1、小檗碱4.3910mg·g-1、黄柏碱1.6900mg·g-1、厚朴酚3.5070mg·g-1、橙皮苷2.0820mg·g-1、甘草苷0.7630mg·g-1和甘草酸0.9730mg·g-1，RSD均小于3.0%(n=6)，表明方法重复性良好。
2.8加样回收试验
取1号样品粉末9份，每份0.5g，分别加入“2.3.1”项下混合对照品溶液4，5，6ml，混合均匀，按照“2.3.2”项下方法制备加样回收样品溶液，按照“2.1”项下条件进行测定，计算回收率。结果表明，12种化合物的加样回收率在96.5%～104.3%之间，RSD均低于4.4%(n=9)。
2.9样品测定
精密称取3个批次的如意金黄散，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积并计算12个成分含量，结果见表3。
3讨论
如意金黄散处方中君药为苦寒解毒药，如大黄、黄柏;臣药为燥湿化痰行气的天南星、陈皮、厚朴和破血行气药姜黄;使药为辛温祛风燥湿、消肿止痛药，如白芷[12]。其药理活性涉及到的化学成分有姜黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、小檗碱、巴马汀、厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷、苍术素、甘草酸、欧前胡素和异欧前胡素等[3]，这些化学成分可通过多种途径发挥协同作用，因此，采用多指标进行药品质量控制是很有必要的。本研究中选择了处方中12种药材的质控成分作为研究对象，能够更全面的对药品质量进行监控。
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如意金黄散由12味中药组成，不同药材中质量控制性成分的化学性质不同，含量测定时提取方法也不同。中国药典2020年版将如意金黄散质量控制指标增加到7个，但含量测定也更加复杂，需采用多种条件进行检测。本研究为了兼顾水溶性成分和脂溶性成分，在供试品处理过程中，在中国药典2020年版基础上，考察了50%，70%和100%这3种比例的甲醇和乙腈为溶剂的提取效果，同时也比较了在提取溶剂中是否加入盐酸对提取效果的影响。通过对不同提取条件下溶液中12种化学成分含量的比较，最终将提取条件确定为盐酸-70%甲醇溶液(1∶100)超声提取40min。
本试验中采用高选择性和高灵敏度的UPLCMS/MS方法，能够在7min内同时测定如意金黄散中12种化合物，为如意金黄散质量控制提供了新的方法。预实验考察了不同组成的流动相(水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇、2mmol·L-1醋酸铵溶液-乙腈、2mmol·L-1醋酸铵溶液-甲醇)对12种成分响应和峰面积的影响。研究发现，采用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇作为流动相时12种化合物的响应和峰型最好。方法学研究显示，该方法灵敏度高、准确度好，能够应用于如意金黄散化学成分的含量测定。——论文作者：姚远1吕光辉2
