分类：文史论文 时间：2021-11-20 热度：533
摘 要：书画与丝织文物在埋藏或馆藏过程中由于受到环境因素等影响易被霉菌污染。霉菌产生的色素和生物酶等代谢产物会造成文物污损，会使材质脆化、褪色甚至腐烂等，从而影响文物的保存及文物价值的延续。书画和丝织文物污染霉菌的分离和鉴定有助于确定文物霉菌防治的重点，有利于减轻霉菌对文物的危害，能更好地延续其价值。在本研究中采用形态学观察及分子生物学技术对北京馆藏书画与丝织文物上分离出的10株霉菌进行菌落形态学和显微观察，并研究霉菌的分泌色素。通过ITS序列分析鉴定10株霉菌属于曲霉和青霉属，并进行系统进化树分析。对分离霉菌的形态学和分子鉴定进行研究，为未来开发生物防霉制剂和防霉技术提供了一些新思路。
关键词：文物;霉菌;分离;分子鉴定
1 背景概述
书画和丝织文物为有机质文物，其构成材料主要是纸和绢。其中含有的有机成分(纤维素、半纤维素、木质素、淀粉和蛋白质)可以成为微生物生长的培养基，容易受到霉菌的污染。①其中纸质文物主要成分为纤维素，更加容易受到霉菌的污染。霉菌对纸质文物的污损主要集中在以下几个方面：①增加纸质文物的酸度，降低纸张的强度，破坏纸质文物的材料结构。②霉菌在纸质文物上代谢产生色素，形成霉斑，使纸质文物褪色或颜色发生变化，它不仅影响了纸质文物的审美价值，而且对文物的历史价值产生了重要影响。③增加纸张湿度，造成粘连，从而导致纸张黏附。④分泌毒素，危害人体健康。②
近年来，通过分离和分子鉴定对不同省市博物馆馆藏文物污染霉菌进行了相关研究。国内不同省市书画与丝织文物由于地理环境和保藏条件的不同，导致文物污染霉菌也存在差异。早期故宫博物院和中国国家博物馆的研究较多。例如：马淑琴等对35件故宫文物上的霉菌进行调查分析，发现主要霉菌为黑曲霉、绿色木霉、桔青霉和黑根霉等。③首都博物馆闫丽等从中国古代书画中分离获得22株真菌，并利用真菌ITS区DNA序列进行进化分析，并通过形态分析以及菌丝的显微镜观察验证了实验结果，确定了引起古代书画文物污染的霉菌是由多种霉菌共同作用的结果，污染霉菌主要包括烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、青霉(Penicilliumtenerum)和黑曲霉(Aspergillusniger)。④武望婷等从出土文物中抽取水样和泥样，通过菌落的微观形态特征、培养特征观察，使用DNA-ITS和β-tubulin生物学方法分离鉴定研究，确定实验室文物样品中主要霉菌属于青霉属。⑤
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不同馆藏的纸质或纺织文物所污染霉菌主要为丝状真菌，由于受到不同埋藏或馆藏环境条件的影响，存在差异。为进一步系统研究北京纸质或丝织文物的主要污染霉菌分类，本研究选取了59个文物样品，来自北京三家文物保藏研究单位。对文物主要污染霉菌进行分离、理化分析和分子鉴定。本研究采用形态学观察及分子生物学鉴定综合方法，提高了文物样本中污染霉菌鉴定分析的准确性，该研究为后期针对性地开发防霉制剂提供了理论依据。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 供试文物样品
纸质和丝织文物样品来源于中国国家博物馆、首都博物馆和北京服装学院三家单位的纸质和丝织文物馆藏样品。以下列举部分代表文物样品的信息。
①古11：北魏(鲜卑)，原所有者不详，内蒙古乌兰察布盟四子王旗城巴子北魏墓出土，未定级，保存状态呈糟朽、污损、内絮丝绵板结现状，裤长115.5厘米，腰围102厘米。
②MFB009915：元代素色辫线袍，原所有者不详，内蒙古出土，未定级，保存状态有糟朽、污损发生，两袖通长184厘米，衣长120厘米。
③MFB009916：元代龙凤纹纳石矢辫线袍，原所有者不详，内蒙古出土，未定级文物，保存状态有污渍、磨损、皱褶、褪色现象，两袖通长163厘米，衣长115厘米。
④MFB009917：元代钱字地滴珠窠龙纹辫线袍，原所有者不详，内蒙古出土，未定级，有污渍、磨损、皱褶、褪色、缺失现象，尺寸为103厘米×90厘米。
⑤MFB9931：元代杂宝团龙纹罟罟冠，原所有者不详，内蒙古出土，未定级，现存状态比较完好，尺寸为27厘米×28厘米。
⑥松赞干布遗训：年代为公元15世纪，来源不详，文物记录中有“阿强办”字样，初步推测移交自阿里地区文物抢救办公室，三级文物。由于受潮或水浸，经书整体严重粘连板结，揭开的经叶之间有霉;单张经叶尺寸约50.5厘米x12.5厘米。
2.1.2 主要仪器和药品
AB204-S型电子天平(瑞士梅特勒公司)、CLIMACELL222型恒温恒湿培养箱(德国3M公司)、MLS-3750型灭菌锅(日本三洋株式会社)、Scentifid1358型生物安全柜(美国Thermo公司)、BX41型显微镜(日本奥林巴斯株式会社)、化学试剂和培养基。
2.2 培养基及霉菌采集方法
2.2.1 分离培养基
马铃薯培养基(PDA)：取200克去皮马铃薯，切成小块，加1000毫升水煮沸30分钟，用双层纱布过滤马铃薯块后加入20克葡萄糖、15克琼脂，之后加水至1000毫升，115摄氏度下高压灭菌30分钟;PDB液体培养基(除不加琼脂外，其他同固体PDA制作方法)，用以液体培养。
2.2.2 霉菌采集方法
将无菌棉签放入直径6厘米的小培养皿中，用高压灭菌锅对其灭菌。在取样时将无菌棉球在书画或丝织文物上的霉斑处轻轻擦拭几次，然后接种到PDA培养基上，最后将PDA培养基放到生物安全柜中在28摄氏度下静置培养。
2.3 霉菌的分离和纯化
将文物霉斑上的取样涂布于固体PDA培养基，在28摄氏度下的恒温培养箱中培养4天。进一步根据生长的霉菌代谢产生色素的颜色(主要为黑色、褐色、黄色)，对不同真菌进行单菌落划线纯化3次以上。选取菌落特征明显及色素产生稳定的菌株进行形态学观察和分子鉴定。
2.4 菌落形态观察
定期连续观察菌落的生长速度、外观、湿润、颜色变化。用无菌镊子从插片培养皿里夹取长有霉菌的插片，放入载玻片上，在光学显微镜下观察菌丝和孢子的微观形态，并进行显微照相。
2.5 霉菌基因组DNA的提取
把经PDB培养基培养在28摄氏度下恒温静置培养3天的菌体离心收集。采用液氮研磨，先用液氮将研钵预冷，然后取样品平摊到研钵中，倒入液氮停止沸腾之后研磨，重复两次，装入离心管。总DNA提取方法按照真菌DNA提取试剂盒(HPFungalDNAKitD3195，OmegaBioTek公司，美国)的操作说明进行，提取的DNA在零下20摄氏度保存备用。
2.6 真菌ITS基因片段的PCR扩增及测序
扩增引物采用真菌核糖体rDNA间隔区通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)。PCR反应体系：PCRBuffer(5x)10微升，dNTP4微升，引物F(终浓度20微摩尔)1微升，引物R(终浓度20微摩尔)1微升，Taq酶1U，模板(终浓度50～100纳克)2微升，水31微升。1.5毫升离心管处模板外反应体系一起混合、离心，每个PCR管分装48微升，然后分别加2微升的真菌基因组DNA。PCR程序采用94摄氏度5分钟，循环25个94摄氏度30秒、50摄氏度30秒、72摄氏度10分钟，4摄氏度保存。
PCR产物跑电泳：①琼脂糖浓度1%，制胶板一般配50毫升，称取0.5克琼脂糖加50毫升电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾，冷却至40摄氏度左右，添加生物染料5微升，倒入制胶板，20分钟左右凝固;②点样，5微升样品及1微升上样缓冲液;③电泳仪设置电压120伏，电泳20分钟;④紫外成像，目的片段在500碱基对左右。目的片段经测序后序列用NCBI在线BLAST比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，分析其与已报道真菌ITS序列的同源性，继而确立所分离菌株的分类学地位。
3 实验结果
3.1 菌落形态学观察结果
对所选用样本中分离纯化的单菌落在PDA平板上于28摄氏度下培养3天，观察发现8株菌株在培养基上显示出不同的菌落颜色和形态特征。其中部分菌株具有高度发育的菌丝，其他菌株未见明显菌丝生长。在PDA培养基观察不同霉菌代谢色素情况，具体结果见表1。对霉菌分离纯化后具体菌落形态特征、其产生分生孢子梗及分生孢子的形态特征进行显微观察，结果统计如下。
①菌株1：在PDA培养基上生长较快，表面灰绿色，菌丝体呈白色。生长3个月后，霉菌代谢产生大量黑色素。
显微形态观察发现分生孢子梗光滑，顶端产生近球形定囊(图1)。
②菌株2：在PDA培养基上表面灰绿色，无明显白色菌丝体。生长3个月后，霉菌代谢产生大量黑色素。显微形态观察发现分生孢子梗粗糙，梗上分生着成串的表面粗糙的球形分生孢子(图2)。
③菌株3：在PDA培养基上表面灰绿色，背面呈浅黄色。生长3个月后菌株代谢产生黄色色素。显微形态观察发现未产生孢子梗，分生孢子呈椭圆形(图3)。
④菌株4：在PDA培养基上表面呈炭黑色，边缘呈白色。生长3个月以后菌株代谢产生褐色色素。菌丝体无色，菌丝有明显横隔(图4)。
⑤菌株5：在PDA培养基上表面呈炭黑色，边缘呈白色。生长3个月以后菌株代谢产生黑色色素。菌丝体无色，菌丝具有明显横隔，分生孢子成串、球形(图5)。
⑥菌株6：在PDA培养基上表面呈灰绿色，菌丝体白色。生长3个月以后菌株代谢产生褐色色素。菌丝体无色，菌丝有横隔，分生孢子成串、球形(图6)。
⑦菌株7：菌落在PDA培养基上呈青绿色。生长3个月以后菌株代谢产生褐色色素。分生孢子顶端的膨大，呈扫帚状(图7)。
⑧菌株8：菌落在PDA培养基上呈灰绿色。生长3个月以后菌株代谢产生褐色色素。菌丝有横隔，分生孢子顶端膨大，呈扫帚状(图8)。
⑨菌株9：菌落在PDA培养基上呈黄绿色，菌丝体呈白色。生长3个月后，霉菌代谢产生褐色色素。显微形态观察发现分生孢子梗光滑，顶端产生近球形定囊(图9)。
⑩菌株10：菌落在PDA培养基上呈灰绿色。生长3个月后，霉菌代谢产生褐色色素。显微形态观察发现分生孢子梗光滑，菌丝有横隔，分生孢子成串、球形(图10)。
3.2 分子生物学鉴定结果
将这10株真菌纯化后进行液体培养，然后利用真菌DNA提取试剂盒分别提取总DNA进行ITS区的PCR扩增。对纯化后的扩增产物18SrDNA序列扩增产物进行测序。测序结果提交到NCBI网站进行比对。发现提交的10个序列与数据库中参照序列的同源性大于或等于97%(表2)。结果表明菌株1、菌株2、菌株4、菌株5、菌株7、菌株9属于曲霉属，另外菌株3、菌株6、菌株8、菌株10属于青霉属。
3.3 系统发育树构建
依据以上菌株18SrDNA序列测序结果利用MEGA软件构建系统发育树。
根据系统发育树(图11)：菌株1、菌株2、菌株4和菌株5，菌株6和菌株10，菌株3和菌株8遗传关系较近，分子生物学检测结果与形态学观察结果基本相符，这表明该研究的分离霉菌形态特性与进化关系比较准确可靠。
4 讨论
我国出土或博物馆中保存着众多纸质及丝织文物，这些文物本身具有较高的艺术价值及文化属性，因此保护这些宝贵的文物至关重要。然而由于纸质及丝织文物本身的特性以及其出土和保藏环境，导致其表面容易污染霉菌，这些霉菌严重影响了文物的保存。①不同的保藏环境导致污染霉菌存在较大差异。唐欢等通过传统的纯培养方法，从纸质书画霉菌污染处分离出8株霉菌，结果表明8种霉菌属于曲霉属、根霉属和木霉属。②廖晓迪等对广西民族博物馆4个仓库、6个展厅中的空气进行采样，并对馆藏25种各种材质的文物进行采样，根据空气中霉菌的总数、种类、分布和霉菌的发生概率对广西民族博物馆进行基础霉菌调查和分析，发现危害书画文物的霉菌类属主要有青霉属、曲霉属、毛霉属等。③本研究选取北京三家文物保护机构的纸质及丝织文物所污染霉菌进行分离、纯化、形态学观察及分子生物学鉴定。通过霉菌分离和纯化获得纸质书画文物污染的10株典型霉菌。10株菌的菌落形态存在明显差异，菌落颜色主要为灰绿色和青绿色。从形态学观察发现分离霉菌为丝状真菌，菌丝生长发达。通过显微观察其分生孢子梗和分生孢子的形态特征，发现其中6株菌(菌株编号1、2、4、5、7、9)具有典型的子囊菌特性，菌落生长较快，表面灰绿色，背面呈黑色或褐色。菌丝发达多分枝，气生菌丝形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊。基于ITS序列分析菌株1、菌株2、菌株4、菌株5、菌株9都与Aspergillusproliferans的ITS序列相似率大于98%，菌株7与Aspergillusniger的ITS序列相似率大于99%(表2)。曲霉属是自然界广泛分布的营腐生生活的真菌属，该属包含有超过250个菌种。另外4株菌菌落呈灰绿色，菌丝具有明显横隔，顶端不形成膨大的顶囊，分生孢子梗上串生多个球形或椭圆形的分生孢子。基于ITS序列分析菌株3和菌株8与Talaromycesaerugineus的ITS序列相似率大于97%。菌株6和菌株10与Penicilliumlimosum的ITS序列相似率大于98%(表2)。从以上菌落形态特征和显微观察结果，表明北京三家馆藏机构的不同保藏纸质和纺织文物样品由于地理环境相似，主要污染霉菌集中在曲霉和青霉属，结果与以前闫丽和武望婷等分别在北京馆藏文物中分离出的霉菌相似。对霉菌的分离与鉴定研究有助于确定防霉和除霉工作的专一性，故未来对馆藏书画与丝织文物上的其他污染霉菌进行大量的分离与鉴定研究是霉菌研究的新思路。
分离的10株菌株在PDA上生长3个月，长时间生长代谢产生的色素也存在明显的差异。如表1所示，菌株1、菌株2、菌株4代谢黑色素，其他菌株代谢褐色素。这些色素颜色与霉菌分离文物的污染颜色相一致。菌株1、菌株2、菌株4、菌株5和菌株9从分类鉴定上属曲霉属，但其分泌色素颜色不同。菌株3和菌株8都属于青霉属，但其分泌色素颜色也存在明显差异。以上结果表明文物污染霉菌种类非常丰富，分离霉菌后曲霉和青霉属种间的形态学特性虽然相似，但其分泌色素的代谢途径存在明显差异。
综上所述，本文对北京馆藏书画与丝织文物上的主要10株霉菌进行了分离与分子鉴定研究。从分离霉菌的形态学特性和分子鉴定结果相一致，并且分泌色素的颜色与取样文物污染颜色相符，说明分离霉菌具有典型的文物污染霉菌特性。对10株霉菌进行系统分析，对未来北京馆藏文物上霉菌的研究提出两点建议：一是文物上的霉菌研究工作应该根据文物污染选取典型样品，对污染霉属要进行系统的生物形态学、分子鉴定及色素产生等多因素综合分析;二是防霉工作应对典型污染霉菌的生长和生理生化特性进行针对性地研究，研发出绿色、清洁、高效的生物防霉新技术。——论文作者：闫丽1洪巍2吕晓芳2
