分类：农业论文 时间：2022-01-20 热度：797
摘 要：拉曼光谱技术具有快速、灵敏、非破坏性等显著特点，在植物科学研究领域得到广泛的应用。本文分析了拉曼光谱技术在植物科学研究领域应用的技术优势，并重点总结和分析了该技术在植物生理生态学、植物遗传发育、植物化学分类学、植物天然产物分析以及植物产品的质量控制中的应用研究进展及前景。
关键词：拉曼光谱;植物科学;综述
1 引言
拉曼光谱技术是以拉曼效应为基础建立起来的分子结构表征技术，1928年因印度学者C. V.Raman发现而命名。近年来，随着激光、检测器等技术迅速发展，拉曼光谱技术的灵敏度得到很大的提高，已被广泛应用于材料、石油化工、高分子、地质等领域[1]。该技术具有非破坏性、检测时间短、样品所需量小，样品制备简单等诸多优点，受到生物和医学研究领域的普遍关注[2]。拉曼光谱技术在植物次生代谢产物[3]、植物性食品[53研究中的应用已有综述。本文从植物科学的学科结构出发，重点总结该技术在植物生理生态、植物遗传及分类、植物源天然产物检测及植物产品的质量控制等方面应用的最新进展，并综合分析了拉曼光谱技术在植物科学研究领域的应用前景。
2拉曼光谱技术及其特点
拉曼和红外光谱(IR)均用于鉴定分子中官能团，前者由分子极化率变化诱导，是分子非弹性散射光谱，后者因分子偶极矩变化产生，是分子吸收光谱。拉曼光谱在很多特征峰上可以与红外光谱相对应，但是，对于电荷分布中心对称的键，如C—C、N—N、S—S等，其拉曼信号强而红外信号很弱。而对于被检测的活体中普遍存在的一些极性分子，如C0。和H。O等，其拉曼信号弱而红外干扰信号很强，使得拉曼光谱在活体的无损检测上具有红外光谱无法比拟的优势。
20世纪60年代以后，激光光源的引入、微弱检测技术的提高和计算机的应用，出现了如傅立叶变换拉曼光谱分析技术(FT-Raman)、共振拉曼光谱技术(RRS)、表面增强拉曼光谱技术 (SERS)、共聚焦显微拉曼光谱技术(CRM)等一系列新的技术[6]。FT-Raman采用1064 nm红外光激发光源减弱荧光背景并提高信噪比，在植物材料分析及活体无损检测中得到广泛应用。 RRS利用激发共振拉曼效应可以极大提高光谱灵敏度，适于检测低浓度和微量样品。SERS可以获得常规拉曼光谱所不易得到的结构信息，因而在植物材料检测中也受到重视。由于拉曼和红外光谱的密切关系，二者常结合来共同表征和测定物质组成和结构。拉曼光谱技术还可以和薄层色谱(TLC)等一些分离技术等相结合实现精细检测，和同位素示踪技术、原子力显微镜等联用可获取更多精细的信息。目前，得益于二极管发光技术的提高，市场开发了785 nm光源的便携式拉曼光谱议，可以进行户外无损检测。这些技术的进步为拉曼光谱技术在生物研究领域中的应用提供了广阔的前景。
3植物生理与生态
3.1植物初生代谢
拉曼效应包含分子构象、电子分布及分子作用力间的相互影响等大量信息，对研究植物光合作用中色素的电子传递十分重要。FT-Raman 可直接测定色素分子的拉曼特征振动峰，区分色素分子种类，同时，谱线强度变化还能基本反映色素分子的含量变化m引。刘玉龙等‘·3的总结表明RRS和SERS技术在光合作用领域的研究已经比较成熟，包括估测二氢叶酚型电子载体的分子结构，测定与蛋白相结合的类胡萝卜素分子的构象，以及强光破坏前后纯化的放氧核心复合物 (Pd OECC)等。但这些实例大部分只与细菌光合作用有关，而来自高等植物蛋白的光合作用则非常复杂，现有的少量研究包括：Rubanc妇等利用低温RRS对光系统II(PSII)的天线化合物中叶黄素循环组分进行了构型研究，在此之后， Andreeva[1阳进一步用RRS光谱明确了光系统I (PSI)中的类胡萝卜素种类(叶黄素、紫黄质、9一反式新黄质和伊胡萝卜素)及其结构差异引起的拉曼谱带归属。赵金涛等r11]利用CRM技术，以 514.5 nm激发光在室温下获得法国梧桐鲜叶的拉曼光谱，表明PS II反应中心色素蛋白复合体为D1/D2/Cyt b-559复合物，复合物中伊胡萝卜素分子为全反式构型，光照射对伊胡萝卜素分子的构象会产生一定的影响。对法国梧桐鲜叶进一步的研究还得到了伊胡萝卜素分子的二级拉曼光谱[121。Ataka等还对藻类利用蓝光的光合色素分子构象进行了研究[13。。这些研究为明晰光合作用功能分子作用机制积累了科学数据。
3.2植物的次生代谢
拉曼光谱能回答诸如配体对大分子的识别、酶的催化等核心问题，为代谢机制研究提供手段。FT-Raman可辨识蛋白中酰胺I、II及III键以及一些特殊的氨基酸所含双硫键的拉曼特征峰，用于定量测定和构象变化的研究[14,15]，还可以实时分析酶一底物相互作用的分子结构变化信息[1 61。RRS可提供花青素糖基化修饰的典型光谱变化特征[171。这为次生产物的酶代谢调控机制研究提供了手段，植物次生代谢产物定位的无损分析较多集中在植物器官水平。如，利用FTRaman技术可以较精确地测定茴香果实中茴香脑、甘菊花序的螺旋醚以及姜黄根的姜黄色素浓度分布[7]，胡萝卜根的糖类物质浓度分布[1引，藤蔓植物中的生物碱分布[19。，等等。
3.3植物与环境关系
FT-Raman技术可以作为植物与环境因子之间响应分析时强有力的工具。已有的报道包括三个方面：(1)植物代谢产物对环境理化因子变化的响应。如，通过植物叶细胞中的色素的特征谱线强度变化进行定量。并表征叶色季节变化机制[71;通过辣椒色素分子的拉曼特征峰强度的动态反映辣椒不同成熟期色素含量的变化[8]，等。(2)植物代谢对环境生物因子胁迫的响应。 Baranski[8]发现番茄等植物受到机械损伤和其他生物胁迫时，体内类胡萝卜素的拉曼特征谱线强度会发生变化，通过不同颜色标记谱线强度能对损伤部位准确定位。Schrader等[20]利用一C 三C一键的强烈极化的拉曼信号，实现对植物体内植保素多炔类的种类和浓度的检测，并结合拉曼绘图技术进行了定位。Shih等[21]研究表明，维生素的饲养可引起罗非鱼类的晶状体蛋白的拉曼谱线变化，这为研究植物一动物捕食生态反馈机制提供了思路。(3)植物的环境毒理方面。具有代表性的是Kamnev等[22]对植物根际细菌的重金属培养实验，研究表明细菌的细胞壁或膜积累重金属可以引起其拉曼谱线的变化，提示拉曼光谱技术在植物环境毒理方面应用的可能性。植物与环境关系是植物生态学领域研究的重点，上述研究仅为初步探讨，关于次生代谢物的精细检测及其在植物组织、细胞及亚细胞水平的拉曼光谱定位还需在方法上作大量研究。
4植物发育与遗传
4.1植物发育
植物的生长发育必然反映在植物细胞壁的形态结构变化[231，利用FT-Raman可以方便地进行分析比较。如Sene等[24]用咪唑作为提取剂，分析了五种被子植物初生细胞壁主要组分的 FT—Raman光谱，表明不同科属问具明显的差异性。此外，植物生长发育及外力响应过程中，植物初生及次生细胞壁所起的作用有所不同[2引， CRM技术的精确定位测量功能在这方面研究中显示出独特的优势。如，CRM技术成功产生了黑云杉植物细胞壁木质素和纤维素的分布图像和白杨的木材细胞壁的结构c2e,27]，并与原子力显微镜联用研究木材纤维形态及抽提物的光谱特征[2引。这些结果为研究植物细胞的生长发育提供了思路。
4.2植物遗传变异
拉曼无损检测技术能够灵敏检测植物活体中受基因调控的结构活性物质，如色素分子、蛋白质等的差异，从而表征植物的遗传差异，对快速选择良好的物种后裔十分有利。如，Baranska[8]采用CRM技术精确分析不同胡萝卜品种根部的类胡萝卜素、口、伊胡萝卜素、叶黄素以及番茄红素的相对浓度，以反映品种问遗传差异。 Sene等[2胡的研究也提示FT—Raman可作为遗传和分类学的研究手段。通过对DNA分子的拉曼光谱研究，可以从分子水平上了解遗传和变异的本质，目前对于这类的研究多集中于药物 (如抗癌药物)、生物分子(酶和蛋白质)与DNA 的相互作用，以及对病毒中DNA的研究。研究表明，DNA分子遗传结构在外源药物或激光照射的作用下发生结构的变化可以通过拉曼光谱仪得到检测[29,30]。随着相关技术的发展，对 DNA分子结构的拉曼光谱检测将更加精确[3¨，这将会极大推动拉曼光谱在植物的遗传、变异方面的研究力度。
5植物的化学分类
5.1植物分类学
将拉曼光谱与聚类分析相结合，可以为化学分类学提供新的快速简便的方法。拉曼光谱技术用于植物化学分类主要有两种途径，(1)通过对特定植物器官的拉曼特征谱线的聚类分析进行植物化学分类。例如，采用FT-Raman光谱技术对松类植物叶拉曼光谱聚类分析，分类的结果与传统分类数据显示出很大的相关性[32l。 (2)直接测定特定的天然产物成分，并通过成分的相关性进行分类。例如，植物中的萜类与其自身的基因控制有很大关系，因此常用作化学分类中的生化标志物。拉曼光谱可以快速获得植物萜类物质的分子振动数据，结合聚类分析可以对某些植物进行化学分类学的研究[33矗引，分类结果与气相色谱分析一致[3引。目前，基于植物组织、细胞与亚细胞三个层次的特征光谱在分类上的应用的研究尚未展开。而这些层次是介于个体与分子水平的重要过渡层次，不仅与传统的解剖特征分类直接相联，还可以提供代谢产物的差异机制，揭示植物遗传进化的信息，值得重视。
5.2植物药材的化学分类
植物药材各自所含化学成分形成的拉曼特征谱峰可作为药物化学分类的基础。郁鉴源[3胡等采用FT—Raman光谱技术成功对23种植物生药材进行了分类。并发现这种分类方法与中药传统上的五味分类法有很大的相关性：主含糖类化合物的药材拉曼特征峰出现在1090 cml 附近，多为甘味;含苯环类化合物的药材拉曼特征峰出现在1600 cm_1附近，多为苦味;荧光干扰强度大，含生物碱的药材拉曼特征峰出现在 1900---1650 cm_1附近，多为辛味。这为民族植物学及传统医学的研究提供了新思路。
6植物天然产物分析
利用拉曼光谱分析技术可以快捷分析植物源天然产物，Schulz和Baranska已经就此作过深入的总结r引。本文仅作简介和补充。
6.1 萜类
萜类是植物精油的主要成分，分布在植物的花、茎、叶、根等部位。研究证明[32_3引，萜类在傅立叶变换拉曼光谱中能表现出自己本身的特征谱线，通过特征谱线能够识别出植物的精油成分。结合这些谱线振动部位与其振动强度，可以分析组成与含量。此外，CRM和SERS技术可以在自然条件下检测这些萜类成份，是植物精油分析的有用工具[3¨。
6.2纤维素及半纤维素
纤维素及半纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，也是影响木材及麻类的经济性状的重要成分，采用FT-Raman以及CRM技术可以方便地分析其组成结构。如，Schrader[381等利用FT— Raman光谱技术成功测定亚麻纤维组成。Edwards等口妇采用FT—Raman光谱技术无损检测到自然生长下植物的纤维分布。
6.3脂肪酸
由C—C键拉伸振动(1600 cm.1)产生的散射光强度与一CH。剪刀式振动模式(1444 cm_1)的比率可以用来准确预测三甘油和非结合植物油的碘值[4引。Sadeghi-Jorabch等还建立了量化模型来确定各种脂肪酸中总的不饱和程度、正反异构体的比率以及烃键中双键的数卧39。。
6.4淀粉与糖类
从各种单、双、寡聚多糖得到的FT—Raman 光谱可以用于糖类物质的鉴别[421。如，1462 am～、1126 cm一、840 cm-1处的特征谱线与糖类物质有关。拉曼光谱分析也可用于直链淀粉和支链淀粉的分析。这两种淀粉的结构性差异可以通过C-H拉伸振动区域(2700～3100 cm-1之间)的谱线得到鉴别[4引。
6.5生物碱
生物碱是一类含N的植物次生代谢产物，其基本组成单位为异戊二烯。它们不仅具有重要生理生态功能，而且大部分具天然药物活性。由于C----C、C_--N、C—N和C_--O键的强烈拉伸振动，不同的生物碱形成了各自的拉曼特征谱线，据此可以分析植物中生物碱的组成与含量。 Edwards采用Raman技术成功区分了可可碱、茶碱等咖啡因类生物碱[4引。
6.6黄酮类
黄酮类化合物也是一种重要的天然药物活性产物，广泛分布于维管束植物中。目前发现的 4000余种的黄酮类化合物，可以分为黄酮醇、黄酮、异黄酮和花色素苷，每类黄酮均可以通过羟基甲基化，酰化，糖化而被修饰。拉曼光谱可以较好用于鉴别种类，并反映其结构特点[1引。如，姜黄素关键信号在1630 cm_1和1601 cm_1处属于苯环的环振动，1185 cm叫和965 cm-1处则由 COC和COH的振动引起，用FT—Raman技术分析姜黄根部姜黄色素浓度分布时，其拉曼谱线特征峰位置几乎与标准品相同[45。。
7植物产品的质量控制
7.1 品质鉴定
利用不同植物种类特征组分拉曼光谱的基团频率振动峰，可建立指纹图谱用于无损快速鉴 ’别药用植物及其伪(混淆)品[46“引。如，1100～ 1630 cm-1属于胡椒碱的拉曼特征谱线区，可作为不同胡椒粉品种的指纹图谱区[40。。FT-Ra— man与薄层色谱(TLC)及表面增强技术 (SERS)联用，可实现中草药主要化学成分的分离与指纹鉴定，并获得其分子结构信息[481，为天然药物分子光谱鉴定提供了简便而可靠的新方法。汪瑗Ⅲ]等用相似的方法在薄层色谱分离斑点原位获得麻黄生物碱衍生物中一对光学异构体。
7.2生产工艺在线监控
研究表明。随着拉曼光谱仪器小型化且检测性能提高，拉曼光谱技术已逐渐用于植物产品加工的在线监控。采用FT-Raman可实时分析麻类作物机械处理过程中纤维组成变化，并用于评价处理工艺的脱杂质性能口8。，用于饮料植物(可可)的在线工艺品质监控[411，用于食用油类不饱键的氧化过程分析[5引，用于苹果采收后自动分拣分级系统等[511。
7.3农残检测
拉曼光谱的无损快速检测特性可以在农残检测上发挥重要作用。周小芳[52’531等用FTRaman对一些水果表面农药进行了测试，结果表明FT—Raman可以同时显示出水果和农药的特征谱，从而识别水果表面的各种有机农药。肖怡琳[55]等采用显微拉曼光谱仪对几种市售农药的分子振动特征峰进行了记录，从而可以对这些农药进行区分。不须经过前期的色谱分离，拉曼光谱可直接定性并定量研究肥料和植物样品中的高氯酸盐，测定的误差在2～4%以内[5引。
8结论与展望
不同的拉曼光谱技术有各自优势。具1064 nm激发光源的FT-Raman因能克服植物材料中的荧光背景，在植物科学研究中具有极大的优势。其它类型的拉曼光谱技术，如结合共振拉曼效应、表面增强拉曼效应、显微拉曼技术等的拉曼光谱技术，可以发挥对植物大分子的构象表征、精细检测及空间定位等独特功能。尤其当拉曼光谱技术与其它分离手段，如层析、色谱及同位素技术相结合，显示出强大的分析功能。激光及检测技术的进步推动了拉曼光谱仪向小型化、低成本和高性能方向发展，使拉曼光谱的在线、无损检测性能更加完善，显示出拉曼光谱在植物科学研究领域更广泛的应用前景。
目前，拉曼技术已经成功应用于植物生理生态、遗传、分类、植物源天然产物检测及植物产品质量控制等方面的研究。但仍有较多的领域尚待加强，这些方面包括：(1)利用共振拉曼和表面增强拉曼技术建立更多植物体内化学成分的痕量分析方法，为研究代谢过程提供检测技术， (2)充分发挥拉曼技术无损检测的优势和植物标本库的系统标本，尝试探讨用拉曼技术研究植物科属种间的关系，明确植物演化进程;(3)将拉曼光谱与其它分析技术联用，研究植物代谢过程中酶及代谢产物的种类及构象变化的机制，建立遗传变异产物差异的快速分析技术，为植物代谢生理及选育种提供便捷方法;(4)充分发挥拉曼光谱技术的无损检测及野外在线检测的功能，研究植物对环境胁迫的响应过程，重点对能发挥重要生态功能的物质，如，生化它感物质、植保素等的定性、定量及定位;(5)在植物分类与结构生物学方面，有待开展植物组织、细胞与亚细胞三个层次的特征拉曼光谱分类研究，为传统的解剖特征分类法提供更多的依据，揭示植物遗传进化的信息。——论文作者：胡宏友。，李 雄
文章名称：拉曼光谱在植物科学研究领域中的应用
