分类：农业论文 时间：2022-01-20 热度：781
摘要：为明确种植辣椒秧苗前后土壤真菌群落结构差异性和相似性，分析辣椒种植对耕作土壤的影响，以云南丘北辣椒和观赏辣椒为试验材料，通过 ITS rDNA 测序技术对根际土壤真菌群落组成进行分析。结果表明，5 个样本中共同含有的 OTU 数为 55 个;门水平下共获得 7 个物种种类，在 4 个辣椒样本中，子囊菌门 Ascomycota 为优势菌，相对丰度均显著高于 CK 空白对照，而担子菌门 Basidiomycota 则显著低于 CK，同时发现壶菌门 Chytridiomycota 只少量存在于一年生丘北辣椒 WG1 (0.32%)和 9F33(0.13%)中，其它样本均未检测出;属水平下，丘北辣椒 WG1、9F33 中的柄孢壳菌属 Podospora 占比显著高于观赏辣椒 Y19278、Y19292 和 CK，而 Y19278、Y19292、CK 均未超过 1%。在 α 多 样 性 比 较 中 ，辣 椒 样 本 Ace 和 Chao1 指 数 均 高 于 CK，但 Shannon 和 Simpson 指 数 仅 观 赏 辣 椒 Y19278 高于空白对照。在 Spearman 相关分析中，子囊菌门与毛霉菌门显著正相关，毛霉菌门与鞭毛菌门显著正相关。主坐标分析中，CK 样本和 4 个辣椒样本真菌群落结构差距巨大。种植辣椒秧苗可显著改变种植前基质土壤的真菌群落结构，提高真菌丰度，改变原有的优势菌群，同时真菌群落结构也受到不同品种辣椒基因型因素的影响。
关键词：辣椒;根际土壤;真菌群落
辣椒(Capsicum annuum L.)是世界上重要的蔬菜 作 物 之 一 ，适 应 性 广 、产 业 链 长 、营 养 成 分 丰富，具有较大的商业开发潜力，栽培面积逐年上升。近年来，研究者采用植物生理学和分子生物学技术已在辣椒育种和栽培研究中取得了长足的进展，然而从微生物角度分析栽培过程中辣椒对土壤的影响则鲜有报道。植物根际土壤受根系活动影响，不同基因型、不同环境下的根系分泌物均对土壤微生物群落产生直接或间接的影响，如 Marques 等[1]发现，低淀粉基因型马铃薯与高淀粉基因型马铃薯的根际细菌组成差异很大，低 淀 粉 基 因 型 马 铃 薯 根 际 环 境 中 ，鞘 脂 菌 属 Sphingobium、Pseudomonas、不 动 杆 菌 属 Acinetobacter、寡养单胞菌属 Stenotrophomonas 和金黄杆菌属 Chryseobacterium 的 相 对 丰 度 显 著 增 加 。 丁 红等[2]研究发现干旱胁迫及干旱低氮胁迫处理均不同程度地提高了花生根际放线菌门和酸杆菌门 的 相 对 丰 度 ，而 降 低 了 变 形 菌 门 的 相 对 丰 度等。另有研究表明，植物根际细菌群落结构和多样性受施肥条件的影响较大，施用肥料降低了花生根际土壤的菌群多样性，但提高了其菌群物种丰度[3]。
文山州作为云南省主要辣椒种植区，常年辣椒 种 植 导 致 土 壤 肥 力 下 降 、化 感 作 用 严 重 等 问题。探究不同辣椒种植前后生境中微生物多样性差异，对改善本地辣椒种植环境、修复栽培土壤有重要生态意义，对辣椒定植生长过程中专用生 物 菌 肥 和 生 物 农 药 的 制 造 也 具 有 指 导 意 义 。本研究以不同品种成苗期辣椒为研究对象，通过 ITS rDNA 扩增子测序对根际土壤真菌群落组成进行测定，探讨不同品种辣椒种植前后对根际真菌群落结构的影响，为挖掘可能对地方特色辣椒品种高效、优质生长起关键作用的真菌类型提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 供试品种及材料
试验辣椒品种分别是本地一年生文山丘北辣椒(Capsicum annuum L.)和 观 赏 簇 生 辣 椒(Capsicum frutescens var. fasciculatum L. H. Bailey)。 其 中 WG1 和 9F33 是 一 年 生 文 山 丘 北 辣 椒 ，Y19278 和 Y19292 是观赏簇生辣椒，均由文山州农业科学院提供(图 1)。种植育苗土壤为市面上购买的商品育苗基质(‘湘正农科’牌，由湖南农业大学湘晖农业技术研究所研制，主要成分为草炭土)，主要土壤化学性 质 如 下 ：碱 解 氮(92.30±0.39)mg/kg、速 效 磷(54.56±0.45)mg/kg、速效钾(938.72±0.11)mg/kg、碳 氮 比 1.47±0.55、pH 5.28±0.03、EC(712.67± 0.17)μs/cm。
1.2 方法
1.2.1 盆栽试验及样品采集
试验地点为文山州农业科学院，时间 2021 年 2—8 月。将发芽整齐一致的不同辣椒种子播种于苗盘(21 孔)中进行盆栽试验，共 5 个处理，分别是：WG1、9F33、Y19278、Y19292、CK(未种植辣椒的原始土壤基质)。每个处理 3 次重复，3 盘为 1 次生物学重。在相同环境下(光照培养箱)进行常规管理。苗龄为 51 d 时，采用 5 点取样法选取植株，将植株整株拔出，抖落附着土壤基质后用单独无菌刷刷取粘附在根表面的土壤基质，各样品混合后放入 50 mL 无菌离心管中，迅速置于干冰中保存运输，后放入-80℃冰箱保存备用。
1.2.2 测定项目
真菌 DNA 提取均使用 Magen 核酸提取试剂盒(MagPure Soil DNA KF Kit)，Equalbit dsDNA HS Assay Kit 检测 DNA 浓度。
真菌以 20-30 ng DNA 为模板，采用 GENEWIZ 公 司 设 计 的 PCR 扩 增 真 菌 ITS rDNA 上 的 ITS2 可变区，引物如下：F：5’-GTGAATCATCGARTC-3’; R：5’- TCCTCCGCTTATTGAT-3’。真菌 PCR 反应程 序 为 94℃ 预 变 性 7 min，94℃ 变 性 60 s，57℃ 退火 60 s，72℃延伸 60 s，共 32 个循环，72℃延伸 15 min，4℃保存。反应体系：50 μL 体系，5 μL 10× PCR Buffer、8 μL DNA 模板、1 μL dNTPs、引物各 2 μL、2 μL Taq DNA 聚 合 酶 、去 离 子 水 30 μL。 通过 PCR 向 ITS rDNA 的 PCR 产物末端加上带有 Index 的接头，按 Illumina MiSeq 仪器使用说明书进行双端测序。
1.2.3 数据质控与分析
原始数据整理采用 WPS 软件。测序数据质量优 化 使 用 Cutadapt 1.9.1、Vsearch 1.9.6 和 Qiime 1.9.1，作图采用 R 语言平台。测序数据优化后质量见表 1。
2 结果与分析
2.1 微生物群落 O T U 分析
试验共采集 5 个样本处理。按 97%相似性对 unique 序列(重复次数>1)进行 OTU 聚类，真菌中 5 个样本共有的 OTU 数为 55 个，辣椒样本中共有的 OTU 是 77 个，其中丘北辣椒中共同含有的 OTU 为 107 个，观赏辣椒中为 93 个。另外，WG1 处理具有较高的 OTU 个数，独有的 OTU 是 21 个，9F33 独有的 OTU 是 10 个，Y19278 独有的 OTU 是 14 个， Y19292 独 有 的 OTU 是 8 个 ，CK 独 有 的 OTU 是 14 个(图 2a)。
对 排 名 前 15 的 OTU 做 热 图 可 知 ，WG1 中 OTU4、OTU15 丰 度 显 著 高 于 其 他 处 理 ，9F33 中 OTU8、OTU10、OTU12 丰 度 显 著 高 于 其 他 处 理 ， Y19278 中 OTU1、OTU13 丰度显著高于其他处理， Y19292 中 OTU11 丰 度 显 著 高 于 其 他 处 理 ，CK 中 OTU6、OTU7、OTU16 丰 度 显 著 高 于 其 他 处 理(图 2b)。OTU 主坐标分析中(图 2)，第一主坐标对样本差异的贡献率为 62.24 %，第二主坐标对样本参与的贡献率为 18.38%。样本点之间的距离越近，说 明 相 似 度 越 高 ，反 之 亦 然 。 WG1 与 9F33、 Y19278、Y19292 在 PCo2 轴上分离，CK 与辣椒样本在 PCo1 轴上分离，说明 WG1 和 CK 样本的真菌群落 结 构 与 其 他 处 理 具 有 较 大 差 异 ，而 9F33 和 Y19292 真菌群落结构相似度较高。
2.2 微生物群落结构分析
真菌门水平下共获得 7 个物种种类(图 3a)，4 个 辣 椒 样 本 中 子 囊 菌 门 Ascomycota 为 主 要 优 势菌 ，占 比 分 别 是 WG1(81.91%)、9F33(91.29%)、 Y19278(83.61%)、Y19292(91.84%)，均 显 著 高 于 CK(45.77%)。在担子菌门中，WG1(1.57%)、9F33 (0.64%)、Y19278(9.47%)、Y19292(0.93%)显著低于 CK(53.47%)。毛霉菌门 Mucoromycota 中，WG1 (0.28%)、9F33(0.33%)、Y19278(0.34%)、Y19292 (0.65%)高于 CK(0.06%);而壶菌门 Chytridiomycota 只少量存在于 WG1(0.32%)、9F33(0.13%)。
属水平下(图 3b)可以看出，4 个辣椒样本中， Conlarium 占 比 高 于 CK，分 别 是 WG1(24.79%)、 9F33(45.05%)、Y19278(20.93%)、Y19292(59.3%)，而 CK 仅 1.05%。在锥盖伞属 Conocybe 比较中则情况刚好相反，CK 样本占比最高达 26.41%，而辣椒样 本 WG1 (0.02% ) 、9F33 (0.02% ) 、Y19278 (8.15%)、Y19292(0%)则明显低于 CK。另外，在一年生文山丘北辣椒中，柄孢壳菌属 Podospora 占比显著高于观赏辣椒，分别是 WG1(1.77%)、9F33 (2.77%)，而 Y19278(0.39%)、Y19292(0.23%)、CK (0.15%)均未超过 1%。
2.3 微生物群落多样性分析
α 多样性比较中，Ace 和 Chao1 是反映菌群丰富度的指标，数值越小表明丰富度越低。Shannon、Simpson 是反映菌群多样性的指标，其数值越小表明群落多样性越低。表 2 中，4 个辣椒样本真菌的 Ace、Chao1 指数均高于 CK，其中以 Y19278 最高。在 Shannon、Simpson 指数中，则仅有 Y19278 高于 CK，说明种植辣椒后明显提高了基质土壤根际真菌的丰度。通过 Spearman 计算关联系数，由图 4 可 以 看 出 ，子 囊 菌 门 Ascomycota 与 毛 霉 菌 门 Mucoromycota 显 著 正 相 关(P < 0.05);毛 霉 菌 门 Mucoromycota 与鞭毛菌门 Mortierellomycota、子囊菌门 Ascomycota 显著正相关(P < 0.05);壶菌门 Chytridiomycota 与 k__Fungi_Unclassified 显 著 正 相 关(P < 0.05)。
3 结论与讨论
土壤微生物群落结构不仅直接影响到养分的转化与组成，也是维持和恢复土壤生产力的主要因素之一[4]。耕地土壤微生物丰度和结构的变化是反映土壤环境质量变 化 的 重 要 生 物 指标[5]。植物生长对根际微生物群落构建有显著影 响 ，本 研 究 5 个 样 本中共同含有的 OTU 数为 55 个 ，其 中 4 个 辣 椒 样本 中 共 有 的 OTU 是 77 个 ，表 明 4 个 辣 椒 样 本中真菌群落有一定的相似性，但 WG1 处理的辣椒样本相较于其他处理具 有 较 高 的 OTU 个 数 ，独 有 的 OTU 高 达 21 个。通过 OTU 主坐标分析 后 发 现 ，WG1 和 CK 与其他处理真菌群落具有较大的差距 ，而 9F33 和 Y19292 真 菌 群 落 结构相似度较高。门水平下 共 获 得 7 个 物 种 种类 ，在 4 个 辣 椒 样 本 中子 囊 菌 门 Ascomycota 为优势菌 ，相对丰度均显著高于 CK 空白对照，而担 子 菌 门 Basidiomycota 则显著低于对照。同时发 现 ，壶 菌 门 Chytridiomycota 只少量存在于一年 生 丘 北 辣 椒 WG1 (0.32%)和 9F33(0.13%)中 ，其它样本均未检测出。属水平下 ，在柄孢壳 菌 属 Podospora 比 较中 ，丘 北 辣 椒 WG1 (1.77%)、9F33(2.77%)占 比 显 著 高 于 观 赏 辣 椒 Y19278(0.39%)、Y19292 (0.23%)和 CK(0.15%)。可见，在相同环境下种植辣椒导致原本土壤的真菌群落结构发生了显著的变化，这一结果与前人研究一致(种植辣椒后对真菌有较大影响，真菌 OTU 数明显增加)[6]。
研究表明，植物可以通过根系释放分泌物来促进或抑制微生物的生长[7]，如碳水化合物、氨基酸、黄酮类和酚酸类物质均可对根际微生物多样性产生影响[8]。Liu[9]等研究发现，花生根系分泌物中的苯甲酸可增加根际土壤中伯克霍氏菌(Burkholderia spp.)的相对丰度。Li[10]等在对玉米根际微生物的代谢能力研究中发现，玉米根际土壤中含有相对丰度较高的与碳、氮循环相关的微生物菌群，参与分解有机酸、糖、氨基酸、纤维素和芳香族化合物等，说明这些物质是影响根际微生物群落形成的驱动力。综上，基于前人研究分析，造成本试验结果的原因可能是试验辣椒材料不同，其根系分泌物不同，导致对种植前土壤微生物群落结构产生显著影响。下一步试验可收集根系分泌物进行代谢组学检测和微生物基因功能注释，具体分析影响微生物结构的分泌物质。
α 多样性分析中，种植辣椒明显提高了根系真菌的丰度，多样性除观赏辣椒 Y19278 高于 CK 外，其他样本均低于 CK，表明观赏辣椒 Y19278 处理显著提高了根际真菌的多样性。通过斯皮尔曼(Spearman)关联系数计算，结果表明本试验条件下某些微生物种类间存在正向作用。优势菌子 囊 菌 门 Ascomycota 与 毛 霉 菌 门 Mucoromycota 显著 正 相 关 ;毛 霉 菌 门 Mucoromycota 与 鞭 毛 菌 门 Mortierellomycota、子 囊 菌 门 Ascomycota 显 著 正 相关 ;壶 菌 门 Chytridiomycota 与 k__Fungi_Unclassified 显著正相关。前人研究表明，根际土壤环境中土壤微生物之间存在协同与竞争机制，其通过竞争营养物质、侵染位点、合成抗生素类物质抑制其他微生物的生长繁殖，同时益生菌可通过分泌物协 同 促 进 某 些 微 生 物 生 长 和 增 强 植 物 免 疫力[11-12]。因此，种植辣椒秧苗可显著改变种植前基质土壤中真菌群落丰度和多样性，同时不同基因型品种辣椒之间对根际真菌群落结构的影响也存在显著差异。这对辣椒生产中不同辣椒环境适应机制研究、挖掘可能对本地辣椒优质高效生长起关键作用的微生物种类提供了研究基础。——论文作者：王 灿 1 ，2 ，张应华 2 ，许俊强 2 ，周华杰 3 ，李 根 4 ，郝希茹 4 ，王绍祥 1*
参考文献：
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文章名称：辣椒秧苗种植对基质土壤真菌群落结构的影响
