分类：农业论文 时间：2022-03-24 热度：1374
摘要:在使用脱细胞方法去除组织器官中的细胞成分后,通常仅保留细胞外基质,以此来获得脱细胞生物支架。 脱细胞生物支架在组织工程领域有广泛研究,应用于多种组织与器官并取得了良好的效果。 脱细胞方法多种多样,在单独使用其中一种方法难以得到好的脱细胞效果时,可将多种方法结合使用以得到较好的脱细胞效果,但也要注意根据不同组织的特点选择合适的脱细胞方法。 获得脱细胞支架后可通过组织学染色等方法检测脱细胞效果及生物相容性等情况。
关键词:脱细胞;细胞外基质;生物支架
生物支架的定义尚不统一,主要有以下几种类型：①由细胞外基质(extracellular matrix,ECM)等生物衍生蛋白所制成的生物衍生支架,如胶原、层粘连蛋白、糖胺聚糖等;②具有组织黏附性和某些生理活性的功能性生物模拟支架,是采用工程学方法再现生物环境的支架;③人体或动物组织去除细胞成分只留下 ECM 的脱细胞生物支架。 脱细胞生物支架是指从人或动物组织中除去具有免疫原性的细胞成分,以形成仅保留 ECM 的动物组织衍生的支架[1] 。 脱细胞组织是由天然 ECM 得到的,在植入体内后,能够随时间的延长逐渐被患者自身的组织所取代,状态良好时还会随患者患处组织的生长而生长。 在调节生物物理刺激,生物化学和分子信号以及空间结构方面天然 ECM 发挥重要作用。 细胞和 ECM 之间的相互作用被认为是动态互益的过程,决定细胞生长情况并触发细胞从增殖到组织结构形成的转变[2] 。 脱细胞生物支架在多种组织、器官中都有应用。 脱细胞的方法主要分为物理法、化学法和酶法,不同的脱细胞方法脱细胞效果不同,对 ECM 的影响也不同。通过脱细胞处理后所获得的脱细胞生物支架已经被广泛应用于组织器官重建。 现对脱细胞生物支架的研究进展进行综述。
1 脱细胞生物支架的研究和应用
目前已有来自各种组织的脱细胞生物支架得以研究和应用。 Song 和 Ott [2] 提出：脱细胞生物支架可作为组织工程学的构建基础,相比合成材料有更大的优势。 脱细胞生物支架维持了天然的生物学结构,并且使部分生物学功能得以保留,已成为最具潜力及可行性的产品与成果转化热点[3-4] 。 脱细胞生物支架在心脏瓣膜、真皮、血管、肝脏等组织器官中均已应用,见表 1。
2 脱细胞方法
2. 1 去细胞化的基本原理 去细胞化的目的是有效去除所有细胞成分,同时尽量减少任何不利影响, 保留有生物活性和机械完整性的 ECM。 无效的去细胞化与炎症反应有关,可减缓或完全抑制建设性重塑结局[27] 。 无论哪种脱细胞方法都能破坏 ECM 的结构和组成。 组织去细胞化的目的是彻底去除细胞和细胞残余物,同时尽可能保留天然 ECM 的三维超微结构和组成。 由于组织特异性因素如细胞密度、基质密度和包括组织厚度和形状在内的几何因素,组织和器官中脱细胞化的最佳方法各不相同。 因细胞残留物无法完全去除,脱细胞过程可能会对基质造成一些破坏[28] 。
从组织中去除细胞的效果取决于组织的来源和所使用的脱细胞方法。 每种方法都会影响剩余 ECM 的生物化学组成、组织超微结构和机械性能, 进而影响机体对材料的反应。常用的脱细胞方法有物理法(冻融、加压、超声等)、化学法(酸、碱、低渗及高渗溶液、非离子型除垢剂、离子型除垢剂、两性离子型除垢剂、金属离子螯合剂等)、酶法(核酸酶、胰蛋白酶、脂肪酶等)以及上述方法的联合使用[29] 。
2. 2 物理法
2. 2. 1 冻融循环 细胞在经过反复多次冻融循环后可被裂解,在不影响 ECM 超微结构的同时也不会减少 ECM 中的蛋白成分[30] ,使用该方法时可加入冷冻保护剂,如 5% 的海藻糖。 郑幸龙等[11] 在制备脱细胞支架时,将组织在 - 80 ℃环境下冷冻24 h 后解冻,反复冻融 2 ~ 3 次,然后再结合化学法灌注来完成脱细胞。 彭章松等[31] 为了制备高质量的脂肪脱细胞基质,将脂肪置于液氮冷冻,后经 37 ℃ 水浴加热融化,反复 5 次;离心后去除上层油脂,后将下层脂 肪 置 于 匀 浆 机, 经 20 000 r/ min 匀 浆 处 理 1 min,然后再用胰酶消化液处理。 可见,冻融循环常作为辅助方法用以脱细胞。
2. 2. 2 压力法 超高压方法可以有效去除血管等组织中的细胞,并具有灭菌效果[31] 。 在脱细胞过程中可以在组织上施加一系列梯度压力,以提高将细胞裂解剂递送到组织中的速度和效率,并使细胞碎片从组织脱离。 Yoshihide 等[32] 在对猪角膜进行脱细胞处理时利用了高静压技术,在有效去除细胞同时也保持了胶原纤维的排列结构。 在低温环境中, 高压能够保持胶原纤维聚集排列,并减少糖胺聚糖的损失。 此外,使用该技术可不另添加除垢剂,无细胞毒性。 然而该技术所需的设备昂贵,制备成本高, 限制了其应用和发展[33] 。
2. 2. 3 机械振荡法 该法为常用脱细胞方法,即将组织浸入化学除垢剂或酶溶液中,然后通过振荡产生的能量破坏细胞,将细胞从基膜分离除去,但直接的机械 力 量 也 可 能 会 造 成 ECM 超 微 结 构 的 损坏[34] 。 使用机械振荡也可视为化学法的辅助手段, 用来加快脱细胞的速度和达到更好的脱细胞效果。以角膜为例,将其置于除垢剂或酶溶液中,施加机械振荡,使除垢剂或酶与角膜基质充分接触,机械振荡本身也具有脱细胞作用,因此可以获得更好的脱细胞效果[35] 。
2. 2. 4 超临界流体法 超临界流体的低黏度和高通量特性可作为简单的脱细胞方案。 使用惰性物质(如二氧化碳)去除细胞的超临界脱细胞化能最小限度改变 ECM 机械性能。 此外,脱细胞后可以在干燥条件下获得组织,因此不需要冻干。 二氧化碳在适中条件下(温度 32 ℃ ,压力 7. 4 MPa)形成临界流体,并且已经显示在置于乙醇溶液中仅 15 min 就能从主动脉组织中有效除去细胞[36] 。 超临界流体在其他组织去细胞化中的广泛适用性仍有待确定。仅使用物理法脱细胞效果有限,一般作为辅助方法与化学法或酶法联合使用[37] 。
2. 3 化学法
2. 3. 1 碱性和酸性方法 在脱细胞方法中使用碱处理和酸处理以溶解细胞质成分以及去除核酸。常用试剂有乙酸、过乙酸、盐酸、硫酸、氢氧化铵, 可以有效破坏细胞膜和胞内细胞器。 姜涛等[23] 在无菌条件下剪除皮下脂肪组织,1 mol / L NaCl 溶液 37 ℃ 24 h,去表皮,2% NaOH 45 ℃ 摇床处理 4 h, 磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saline,PBS)冲洗至溶液呈中性。 冷冻干燥,4 ℃ 保存备用。
2. 3. 2 非离子型除垢剂 非离子型除垢剂因对组织结构的影响相对温和,已广泛用于各种组织器官的脱细胞。 非离子型除垢剂会破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用,留下蛋白质-蛋白质相互作用, 使组织或器官中的蛋白质在经过非离子型除垢剂处理后仍留有功能性的构象。 Triton X-100 是研究最广泛的 用 于 脱 细 胞 的 非 离 子 型 除 垢 剂。 Triton X-100 对 ECM 的蛋白成分、糖胺聚糖和生长因子等的损害较十二烷基硫酸钠( sodium dodecyl sulfate, SDS)小[38] 。 邢辉等[39] 先采用 Triton X-100 和脱氧胆酸钠处理的方法制备出了脱细胞脊髓支架,其后又采用碳二亚胺交联结合化学萃取法(液氮结合 42 ℃恒温水浴反复冻融 6 次 + 1% Triton X-100 + 1% 脱氧胆酸钠 + 碳二亚胺交联 + 液氮结合 42 ℃恒温水浴反复冻融 6 次 + 1% Triton X-100 + 1% 脱氧胆酸钠)制备脱细胞脊髓支架。
2. 3. 3 离子型除垢剂 离子型除垢剂对细胞质和细胞核膜两者均有效,脱细胞效果比非离子型除垢剂更好,但会破坏 ECM 中的蛋白结构,并且会损失部分基质成分。 常用的离子型除垢剂包括 SDS、脱氧胆酸钠和 Triton X-200。 采用 SDS 从组织去除细胞成分非常有效。 Uygun 等[40] 首次通过门静脉插管向肝灌注梯度浓度的 SDS 制备出了大鼠脱细胞的肝支架。 姜楠等[41] 在制备大鼠肝脏脱细胞支架时,先后使用 0. 01 mol / L PBS、0. 01% SDS、0. 1% SDS、1% SDS 以及 1% Triton X-100 进行灌注。 其中 Triton X-100 作为辅助试剂。
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2. 3. 4 两性离子型除垢剂 两性离子型除垢剂的亲水基团上的净零电荷在去细胞化过程中保护蛋白质的天然状态。 两性离子型除垢剂包括 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸盐,磺基甜菜碱。与非离子型除垢剂相比,磺基甜菜碱显示出更好的 ECM 保存效果和细胞去除效果[42] ,相比 SDS 离子型除垢剂,3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸盐保留更多的胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白,同时仍能去除 95% 的细胞材料[43] 。
2. 3. 5 低渗和高渗溶液 用低渗或高渗溶液进行渗透性休克,如去离子水或低离子强度溶液可使细胞膨胀裂解[44] 。 低渗溶液通过渗透效应破坏细胞膜,联合除垢剂使用更有利于溶解细胞。 高渗溶液能增加 DNA 的溶解度,在脱细胞后期能够清除洗脱支架中 残 留 的 核 酸 成 分[45] 。 如 在 低 渗 溶 液 中 10 mmol / L三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 盐 酸 盐, 5 mmol / L 乙二胺四乙酸( ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)处理 11 h,然后在高渗溶液 50 mmol / L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,1 mol / L NaCl,10 mmol / L EDTA 中处理 11 h 可引起细胞裂解,但仅使用这种方法仍会残留部分细胞成分[46] 。 通常需要结合酶或化学方法来去除细胞碎片。
2. 3. 6 螯合剂 EDTA 和 EGTA 等螯合剂能够与中心金属离子牢固地结合在一起形成一个环状分子复合物。 Ca 2 + 和 Mg 2 + 是细胞附着于胶原蛋白和纤连蛋白的 Arg-Gly-Asp 受体所必需的二价阳离子。螯合剂通过结合二价阳离子使细胞难以附着于 ECM 上,从而达到去除细胞的目的。 EDTA 通常与胰蛋白酶组合使用。 赵小军等[47] 用叠氮钠溶液处理后刮去兔膀胱黏膜层,清洗后将置于 EDTA 和胰蛋白酶混合溶液中浸泡,并用甲醛、戊二醛交联保护,再经过漂洗后分别用 0. 9% NaCl 注射液、脱氧核糖核酸酶、脱氧胆酸钠浸泡,成功制备兔膀胱脱细胞支架。
2. 4 酶法 去细胞化所用的酶包括胰蛋白酶、核酸酶、半乳糖苷酶、嗜热菌蛋白酶等。 酶类可以特异性去除细胞残余物及部分 ECM 组分。 但单用酶类去细胞效果不足,并且支架中可能残存的酶会激发免疫反应,也会影响组织细胞化[30] 。 核酸酶(脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶) 能破坏核酸序列,有助于去除核酸成分;但核酸酶也会对 ECM 成分及表面结构造成损害[48] 。 胰蛋白酶是脱细胞方案中最常使用的酶,钱闯等[49]将肌腱纤维束在无菌操作下置入丝氨酸蛋白酶抑制剂中,在室温条件下处理 24 h。无菌 PBS 冲洗后,移入低浓度胰蛋白酶和乙醇混合溶液中,在不破坏 ECM 的情况下去除细胞壁,室温下处理 5 h 后,再将纤维束移入脱氧核糖核酸酶溶液中处理 5 h。 最后将支架用 PBS 冲洗 48 h,置于无菌室内在室温条件下干燥。 成功制备牛肌腱脱细胞支架。
3 脱细胞效果验证方法及对支架的评价
3. 1 验证细胞去除 经苏木精-伊红染色观察可见脱细胞基质为红色,未观察到细胞核,且观察不到细胞残余现象,表明获得理想的脱细胞支架材料。 对制备好的脱细胞支架用扫描电镜观察, 可见包含大量呈交错排列的白色胶原纤维,表面未出现细胞碎裂残片,进一步验证了脱细胞的效果[47] 。 路英进等[50] 还使用了细胞核荧光染色的方法来观察。 苑志国等[10] 使用 DNA 定量分析来判断脱细胞后的 DNA 残留,结果显示脱细胞后 DNA 残留小于 100 pg / mg。
3. 2 去除残留的化学物质 一般采用 PBS 清洗数小时,以去除脱细胞过程中所使用的化学物质,并洗去残余的细胞碎片[51-52] 。 刘宾等[53] 采用超声空化法,将脱细胞血管支架修剪为 5 mm × 25 mm 的片状,置于 0 ℃ 的 PBS 溶液中,用经过灭菌处理的超声探头垂直浸入 PBS 液中约 2 cm,超声处理 60 s, 累计强度为 300 W,在进一步去除脱细胞支架中残余化学物质的同时,疏松化程度明显提高,仍保持良好的生物学相容性,且种子细胞在支架内的生长情况明显好于未经超声处理的支架。
3. 3 干细胞与脱细胞支架的生物相容性 通过测定干细胞在脱细胞支架浸提液与在杜氏改良 Eagle 培养基中增殖率和生长曲线,可以判断干细胞与相应脱细胞支架的生物相容性。 赵阳等[54] 用此法得到：在第 1、3、5 天,在脱细胞支架浸提液中干细胞增殖是杜氏改良 Eagle 培养基的 98. 8% 、104. 2% 、 111. 1% ,平均相对增殖率为 104. 7% ,差异无统计学意义(P > 0. 05),两组的生长曲线也无明显差异,生物相容性较好。 蒋丹等[55] 也通过对比细胞形态表征,即细胞在支架上增殖后再通过扫描电子显微镜和荧光显微镜观察来判断脱细胞支架的生物相容性。
4 小 结
目前,已经有较多生物支架材料产品成功用于临床,其中不乏脱细胞生物支架产品,并且脱细胞支架更是研究热点。 对组织进行去细胞化时,有多种脱细胞方法可以选择,或将多种方法结合使用以达到更理想的脱细胞效果。 在构建生物支架时,将脱细胞支架与其他材料结合构建复合支架以达到预期目的也是一种选择。 脱细胞方法的选用需要考虑多种因素：组织的来源、细胞数量、致密程度以及脂质的含量、厚度等。 不同的脱细胞方法及所使用的脱细胞试剂都会对 ECM 产生不同程度改变或破坏,尽量减少对 ECM 造成不必要的破坏是脱细胞的目标。——论文作者：范志强，刘雯恩，周艳芳，李玉玲，杨家华，彭新生※
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文章名称：脱细胞生物支架的研究进展
