分类：农业论文 时间：2022-04-15 热度：632
摘 要: 研究玉米||大豆种间互作对根际微生物群落结构的影响及其与产量的关系, 对于深入理解特定作物间套作模式的产量效应有重要理论与实际意义。本研究应用随机区组试验设计方法, 在玉米与大豆以最佳间作比例 (2∶3) 条件下, 采用无隔 (无隔离)、网隔 (尼龙网分隔)、全隔 (塑料薄膜分隔) 3 种种间根系间隔处理, 并以两作物的单作为对照, 借助 BIOLOG 和 T-RFLP 技术对不同处理下间作玉米与大豆的根际微生物多样性进行分析, 探究不同种间互作对微生物结构和功能的影响及其与复合作物群体产量的关系。结果表明, 玉米||大豆间作下, 无隔、网隔和全隔的根际土壤阻断处理的土地当量比分别为 1.39、1.13 和 0.98, 同一间作模式下种间根系互作加强, 土地当量比随之提高。进一步分析表明, 无论是间作玉米还是间作大豆, 其根际土壤微生物多样性和均匀度指数均随根系互作加强而明显提高。AWCD 分析根际微生物生理种群差异的结果显示, 在玉米与大豆间作体系中, 无隔和网隔处理的根际微生物对底物碳源利用能力分别占据第 1 和第 2 位; 全隔和单作下, 根际微生物对底物的利用能力相应降低; 而加强种间根系互作 (即从网隔到无隔), 大豆根际微生物对 6 大类碳源底物中酚类碳源和羧酸类碳源利用能力有所下降, 对胺类碳源、聚合物类碳源、氨基酸类碳源和碳水化合物底物的利用能力分别提高 181.01%、32.6%、 37.84% 和 78.28%; 而玉米根际微生物对酚类碳源、聚合物类碳源和氨基酸类利用能力有所下降外, 对羧酸类碳源、碳水化合物类碳源和胺类碳源等底物利用能力分别提高 46.26%、6.54% 和 15.84%。T-RFLP 分析结果发现, 与全隔处理比较, 无隔处理的大豆根际红球菌属和喜盐芽孢杆菌属等优势菌群丰度明显增多。而玉米根际微生物中也发现相似生理功能红球菌属和芽孢杆菌属等有益优势菌群的丰度增多现象, 最终导致间作作物地上部产量和土地当量比提高。
关键词: 大豆||玉米间作; 种间根系互作; 根际微生物; 细菌; 群落结构; 多样性; 土地当量比
全球人口迅速增长给粮食生产带来巨大压力的同时, 也给环境生态和农业持续发展带来严重的影响 [1]。作物多样化的种植体系, 例如作物间套作, 是发展可持续农业的可行性策略, 也是南方多熟种植制的主要技术手段。与单作处理比较, 豆科 (Leguminosae) 与禾本科 (Gramineae) 作物合理间套作, 彼此对营养吸收和产量表现均有明显的互惠作用。因此, 在传统农业实践中, 特别是我国南方各省, 人们常利用这一技术来发展多熟种植制, 以提高作物复种指数, 达到增加产量的目的。张福锁院士团队研究指出, 在全球层面上, 间套作设计及管理有两种不同的模式, 即以粮食作物与玉米 (Zea mays) 间作和以禾谷类作物与豆科植物混作或条播间作模式[2]。前者在我国广泛推广应用, 该模式共生期短、肥料投入相对高, 增产效应大; 后者则在欧洲广泛应用, 其共生期长、肥料投入较低, 增产效应高。当前中国应用的 100 多种间作组合中, 70% 的组合都有豆科作物的参与[3-4]。豆科禾本科间作体系作为一种可持续发展的种植模式不仅引起了许多国家的关注[5] , 而且豆科禾本科作为世界上重要的粮食作物对于保障全球粮食安全具有重要意义[3]。豆科禾本科间作体系被广泛应用的原因在于豆科作物由于自身的固氮作用, 能够有效固定空气中的氮, 在与禾本科作物间作时, 其所固定氮素的一部分可以通过各种途径转移并被禾本科作物所利用, 从而提高氮素的利用效率[6-9]。另一方面, 豆科与禾本科作物间作使得地上部以及地下部的时间、空间生态位分离[9] , 从而能够更好地利用光、热、水分等资源, 同时挖掘土壤中不同层次的养分资源, 达到显著提高产量的优势。根际是养分、水分和有害物质进入作物系统, 参与食物链物质循环的必经之门户, 因此它是植物-土壤-微生物相互作用的重要界面, 已成为近年来人们关注的重点领域。
前人对禾本科与豆科作物间套作体系增产机制的研究多集中于补偿效应, 即从资源利用生态位分化和种间互惠方面解释增产效应, 如玉米||蚕豆 (Vicia faba) 的间作中, 玉米根系生长深度高于蚕豆, 而蚕豆根系深度更浅, 所以它们存在生态位互补效应。从中不难看出, 这是基于作物间套作的土地当量比研究增产效果的。但土地当量比, 因该常数具有无量纲特性, 所以很难直观地反映间套作比单作在单位面积上的产量优势[10]。近年来, 研究认为, 种间互惠现象在作物间作中更多体现为养分资源利用有效性。比如玉米与蚕豆合理间作, 其中豆科作物蚕豆的根系能分泌化感活性物质, 如一些小分子有机酸和质子等, 活化土壤中难溶性磷元素, 提高禾本科作物玉米对土壤中磷元素的吸收能力[11-12]。选择和补偿效应的贡献在不同间作体系间存在差异, 在矿物质营养的获取上, 玉米||蚕豆主要依赖于补偿效应, 而玉米||鹰嘴豆 (Cicer arietinum) 在磷获取上既有选择效应, 也有补偿效应[13]。可见, 种植制度可有效调节作物间的生态互惠关系。
近年来研究认为, 豆科禾本科间作作为不同作物种类组合而成的复合群体, 对根际微生物数量、生物量及种群结构和多样性有很大影响[3]。沈雪峰等 [14] 在对甘蔗 (Saccharum officinarum)||花生 (Arachis hypogaea) 间作系统的研究得出, 间作与单作相比能够显著提高花生和甘蔗根际土壤细菌及真菌的数量。章家恩等[15] 研究表明, 间作能显著提高玉米和花生根区的土壤细菌数量, 但土壤真菌及放线菌数量只在间作玉米根区得到显著提高。宋亚娜等[16] 在对小麦 (Triticum aestivum)||蚕豆间作体系的研究中发现, 根际细菌群落多样性在小麦和蚕豆生长进入花期时得到显著提高。陈平等[17] 研究结果发现, 玉米与大豆 (Glycine max) 套作具有养分资源高效利用、增强土壤肥力和综合高效的特点, 该团队研究还认为, 增强这两种作物的种间根系互作能有效地促进耗氧性作物玉米根系向水平生长发展, 这不仅有利于增强间作作物玉米对水分和养分的利用潜力, 又能改善玉米地上部的生长发育, 进而实现增产目的; 然而, 增强这两种作物的种间根系互作, 会引起共生期大豆根系在水平方向上分布减少, 也不利其后期的恢复性生长, 最终导致叶面积指数 (LAI) 下降和净光合作用降低, 分枝数、分枝荚数减少而减产; 但玉米与大豆间作对根际微生物多样性的影响研究还不深入。国内外已有不少研究表明, 根际土壤微生物对植物生长发育起到极其重要的作用, 因而被称之为植物第二基因组。根际土壤中庞大的微生物群落彼此形成生命共同体, 深刻影响着共生生物的生长发育过程。这是由于根际微生物组能够直接与植物形成共生、寄生或腐生关系, 或者通过促进土壤有机质分解和养分转化, 参与土壤中生物地球化学过程和生物养分小循环, 进而影响植物对营养养分的吸收和生命过程。同时, 植物对根系微生物具有选择性, 微生物群落的变化也能够影响宿主植物及其共生生物, 导致不同的土壤反馈效应[18-19]。因此, 充分理解土壤微生物对间 (混) 作体系种间互作和多样性-生产力关系的调节机制, 对于优化作物系统结构、提高复合作物群体产量和光温等资源利用效率、发展绿色高质量农业具有重要意义。
Biolog ECO 生态板技术是利用四唑紫在获得电子后颜色变化的特征来监控和评价微生物对特定底物的代谢能力。由于土壤中的微生物通过呼吸作用, 氧化其所吸收的底物以获得能量, 该过程中所产生的电子则易于被四唑紫吸收, 从而指示微生物利用底物的过程和程度。然而, 由于可培养的土壤微生物不到 1%, 因而采用这种方法有一定的局限性。应用分子生物学方法可以克服上述方法的不足。末端限制性片段长度多态性 (T-RFLP) 是一种描述性的指纹图谱技术, 基于不同小亚基 rRNA 基因序列类型之间的末端限制性片段长度多态性。该技术可以从分子水平全面地分析包括细菌和真菌在内的土壤微生物群落种类和功能, 可实现土壤微生物的原位测定, 同时具有操作简便、高通量以及重复性好等优点。前人研究认为连作会导致土壤微生物种类从营养丰富型的细菌性菌群向营养贫乏型的真菌性菌群转变, 禾本科与豆科作物间套种的根际土壤微生物变化方向则相反, 即以营养丰富型的细菌菌群为主[20-21]。然而玉米与大豆间作互惠的机制是什么, 尽管前人已从营养生理学角度作了深入研究[11] , 但这种种间互作的根际微生物特性还有待进一步研究与揭示。据此, 本研究通过局部控制方法, 设置无隔、网隔、全隔和对照 (单作) 处理, 由此产生地下部不同的种间根系互作环境, 并借助 BIOLOG 和 T-RFLP 等技术方法, 深入研究玉米||大豆种间互作对根际细菌微生物群落结构的影响及其与产量的关系, 以期为深入理解特定作物间套作模式的产量效应和根际微生态特性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地与供试材料
试 验 地 位 于 福 建 省 莆 田 市 大 洋 乡 瑞 云 村 ( 25°43′E, 119°5′N, 海拔 328 m) 福建农林大学生命科学学院实习基地。供试土壤类型为棕红壤, 土壤肥力良好。其中, pH 6.48, 速效氮 123.68 mg·kg−1、速效磷 25.06 mg·kg−1、速效钾 80.09 mg·kg−1。
在 2015 年 3 月 31 日播种前, 以复合肥为基肥, 施肥量占总施用量 (300 kg·hm−2) 的 50%, 其余用作追肥, 于玉米拔节期之前一次性施用。复合肥中三要素含量 N、P、K 均为 15% (即三者比例为 1∶1∶1)。试验期间, 在玉米拔节期、大豆分枝期和玉米、大豆的花期分别进行定量灌溉和人工除草。
供试玉米品种为广泛推广的‘花糯 66’杂交玉米品种; 大豆品种为当地常用丰产品种‘闽豆 1711’, 株型直立, 抗病性好。
1.2 间作比例和分隔试验设计
最佳作物间作比例的确定: 2014 年 8 月进行田间试验。玉米和大豆株行比参考刘朝茂等[22] 分别设置为 2∶2、2∶3 和 2∶4, 每小区条播玉米两条带, 大 豆为 2、3、4 条 带, 其中大豆株行距为 35 cm× 35 cm, 玉米为 30 cm×30 cm, 玉米和大豆的行间距为 35 cm。每组试验处理重复 3 次, 进行大豆||玉米最优株行筛选。结果认为玉米与大豆间作以 2∶3 株行比下产量最高, 其土地当量比 (LER) 最大。据此本试验采用这一间作的最佳行比 2∶3。
玉米||大豆根系分隔试验设计: 试验于 2015 年 3 月进行。采用单因素完全随机设计, 试验重复 3 次。试验地共设 15 个种植小区, 每个小区 10 m2。玉米|| 大豆相邻株间分别采用塑料隔膜使种间根系全部隔离 (简称“全隔” , polythene film barrier, PB; 使根系、根系分泌物质以及根际微生物无法通过)、300 目尼龙网隔离 (简称网隔, mesh barrier, MB; 保证种间根系不会互穿, 但种间根系分泌物可以相互交流) 和未隔离 (简称无隔, no barrier, NB; 种间根系可以互穿)3 种处理 (图 1)。在 2015 年 3 月 31 日大豆和玉米同时播种, 其中单作玉米株行距为 35 cm×35 cm, 大豆为 30 cm× 35 cm, 每穴留1 棵秧苗。为计算土地当量比, 分别以单作玉米(monoculture maize, MM) 和单作大豆(monoculture soybean, MS) 为对照, 种植密度和水肥管理与上述保持一致。
1.3 样品采集
于 2015 年采用五点取样法采集田间土壤样本, 每处理取样 3 次。在玉米和大豆分别进入成熟期和鼓粒期时, 采用铲子收集玉米和大豆表层 0~5 cm 的土壤, 然后用铲子挖出玉米和大豆根部, 采集紧贴在根表面的根际土。各处理随机选 2 个间作带, 各取带内 3 株作物。收集的土壤样品过 2 mm 筛以去除石头、植物残体和杂物等后, 立即放入−80 ℃ 超低温冰箱保存, 用于后期的试验; 另外一部分用于土壤化学性质测定。
1.4 土壤有效养分测定
对处理土壤样本进行土壤氮、磷、钾有效养分含量的测定, 测定方法均参照关松荫[23] 的方法。
1.5 间作作物产量测定
在大豆和玉米收获前 3 d (2015 年 7 月 31 日) 取样测产, 采集每个小区的全部玉米穗并人工脱粒, 分别装好袋子并标记, 烘干称重, 计算单位面积产量。同样随机收割每个小区大豆, 分别装好袋子和标记, 烘干称重, 计算单位面积产量。
1.6 根际土壤细菌群落测定
1.6.1 BIOLOG ECO 微平板测定法
取上述待测不同处理的大豆和玉米根际土壤样本, 采用 BIOLOG ECO 微平板法进行试验操作: 称取 5 g 新鲜根际土置于灭菌后的三角瓶中, 加入 100 mL 0.15 mol·L−1 NaCl 无菌溶液, 封口, 120 r·min−1 恒温振荡器中震荡 30 min, 冰 浴, 静置 5 min。取上清液 5 mL 于灭菌的 100 mL 三角瓶中, 加入 45 mL 上述无菌水, 重复稀释 3 次, 制得 1∶1000 的提取液, 用于 ELSIA 反应。将 BIOLOG ECO 平板预热到 25 ℃, 用移液器取 150 μL 提取液于各个孔中, 28 ℃ 恒温培养, 在 0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 和 7 d 用 ELISA 反应平板读数器读取 590 nm 的吸光值[25]。
1.6.2 T-RFLP 测定法
土样 DNA 提取: 取上述同一处理的土样提取土样 DNA, 提 取 方 法 参 照 Bioflux 公 司 生 产 的 土 壤 DNA 试剂盒说明书步骤进行, 并保存于−80 ℃ 冰箱。
PCR 扩 增: 引 物 序 列为 27F-FAM (5'-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3') 和1492R (5'-GGTTACC TTG TTACGACTT-3'), 其中 27F 的 5'端以荧光染料 FAM 标记。试验使用 PCR 扩增仪, 使用的反应体系为 50 μL 体系: 1.0 μL 1492R, 1.0 μL 27F, 1.0 μL 模板 DNA, 1.0 μL DMSO, 1.0 μL BSA, 25 μL 2×Taq Mix, 20 μL ddH2O。扩增条件: 94 ℃ 变性 l min, 56 ℃ 退火 45 s, 72 ℃ 延伸 1.6 min, 35 个循环; 第一步 94 ℃ 预变性 5 min, 最后一步结束于 72 ℃, 继保温 10 min, 4 ℃ 保存。之后 PCR 产物进行切胶回收, 并采用 1.5% 的琼脂糖凝胶进行检测, 按照美国 Omega Bio-Tek 公司生产说明书的胶回收试剂盒的方法步骤进行回收。
PCR 产物酶切: 纯化回收的 16s rRNA 片段采用 4 种限制性内切酶 (MspⅠ、HaeⅢ、AfaⅠ、AluⅠ) [ 这 4 种酶购于宝生物工程 (大连) 公司 ] 进行 4 酶切, MspⅠ 或 AfaⅠ的酶切体系 (20 μL) 为: 10 μL 目的片段 (0.6~0.8 μg), 2 μL 10×T buffer, 2 μL 0.1% BSA (TAKARA BIO, Otsu, Japan), 1 μL MspⅠ或AfaⅠ (10 U), 5 μL ddH2O。HaeⅢ或 AluⅠ的酶切体系 (20 μL) 为: 10 μL 目的片段 (0.6~0.8 μg), 2 μL 10×L buffer, 1 μL MspⅠ或 AfaⅠ (10 U), 7 μL ddH2O。放于 37 ℃ 水浴锅中进行酶切 4~5 h, 同时在酶切过程中注意避光。由北京诺禾公司测序。
1.7 数据分析
土壤细菌群落 ELISA 反应采用 BIOLOG 平板每孔颜色平均变化率 (average well color development, AWCD) 表示, 并参照植物生态学方法[26-28] 计算 Shannon-Wiener 指数、Simpson 指数和 McIntosh 指数, 以比较不同样品的土壤微生物群落结构相似性。数据整理采用 Excel 2010, 采用 DPS 7.05 软件进行单因素方差分析, 多重比较用 LSD 法 (P<0.05), 主成分分析 (PCA) 采用 SPSS 19.0 软件进行。
2 结果与分析
2.1 玉米和大豆在不同种间根系互作下的产量表现
由表 1 可见, 全隔、网隔和无隔处理下玉米的籽粒产量随根间互作的增强而提高, 其中无隔处理比单作对照显著提高 61.02% (P<0.05)。玉米的百粒重与其籽粒产量表现一致, 各处理均高于单作, 无隔和网隔处理下百粒重比单作百粒重提高 21.88% 和 19.48% (P<0.05)。
就大豆产量而言, 较单作大豆, 无隔和网隔处理的大豆籽粒产量显著提高 39.15% 和 46.25% (P<0.05),而全隔处理则差异不显著; 大豆百粒重的表现与籽粒产量趋势类似, 具体为: 网隔>无隔>全隔>单作, 其中网隔比单作显著增加 9.82% (P<0.05), 其他处理之间差异不显著。
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就 LER 而言, 无隔处理的 LER 为 1.39, 显著高于其他两个处理 (P<0.05), 说明无隔处理与其他处理相比, 土地资源利用效率最高, 因而产量表现也最高。网隔处理的资源利用效率次之, 其 LER 为 1.13。全隔处理最小, 为 0.98, 说明其资源利用效率不及单作处理。可见, 不同根系互作处理对复合群体地上部产量有明显影响, 表现在无隔处理的土地当量比最高, 因而其复合群体产量也最高, 网隔处理 (即不完全隔离处理) 产量居中, 而全隔处理 (即全隔) 的最低, 说明种间根系互作强度增强对作物间作产量具有明显促进作用, 这可能与根系互作强度不同导致根系微生物组成差异有关。
2.2 不同种间根系互作下玉米和大豆的根际土壤细菌群落变化
在玉米与大豆间作体系中, 每隔 24 h 测定 1 次 AWCD 值, 得到其随时间变化的动态图 (图 2), 随着培养时间的延长, 微生物对碳源的利用量增加, 24~ 120 h 不同碳源被利用的变化方式明显不同。图 2 显示, 玉米和大豆的根际微生物群落均为无隔处理对底物碳源的利用能力高于其他处理, 网隔次之, 全隔和单作较为接近。可见, 无隔和网隔处理下, 根际土壤微生物群落对碳源底物利用总能力最强, 全隔和单作处理最弱。这说明越强的种间根系互作, 微生物群落结构组成也越复杂, 其代谢能力也越强。
2.3 不同种间根系互作下间作玉米、大豆的根际土壤微生物对碳源底物的利用强度
表 2 显示, 大豆根际土壤微生物对 6 大类碳源底物利用能力最强的为酚类和羧酸类, 对碳水化合物类利用能力最弱; 而玉米根际微生物对酚类和羧酸类 (无隔和网隔) 或酚类和聚合物类 (全隔和单作) 利用能力最强, 对碳水化合物类利用最弱。对酚类利用能力最强、对碳水化合物类利用能力最弱是两种作物的共同特点。同时, 随着种间根系互作的增强, 大豆根际土壤微生物对上述 6 大类碳源利用能力除了酚类和羧酸类有所下降或下降不明显外, 对胺类、聚合物类、氨基酸类和碳水化合物类等 4 大类碳源底物利用分别平均提高 181.01%、32.6%、37.84% 和 78.28%。而玉米根际微生物, 除了对酚类、聚合物类和氨基酸类利用水平有所下降外, 对羧酸类、碳水化合物类和胺类的碳源底物利用分别平均增加 46.26%、6.54% 和 15.84%。这一结果再次说明大豆和玉米种间根系相互增强对其根际土壤微生物利用碳源效果明显不同。
2.4 不同种间根系互作下间作玉米、大豆的根际土壤微生物群落主成分分析
分析结果如图 3 所示, 与土壤微生物碳源利用功能多样性相关的有主成分 1 (PC1)、主成分 2 (PC2), 两者分别解释了方差变量的 27.88% 和 26.06%。进一步分析结果显示, 5 种根系互作处理的根际土壤微生物菌群组成得到很好的分离。在 PC1 上无隔、网隔和全隔处理的间作大豆和单作大豆之间的根际微生物菌群组成有明显差异, 分别位于不同的区间 (象限), 其中无隔和网隔处理的大豆根际微生物聚虽然分布在不同的区间内, 但相对距离较近; 而全隔和单作处理的大豆根际微生物组成相近, 聚集距离最短; 可见, 网隔和无隔处理的大豆根际微生物差异相对较小, 聚在相近区域, 可归为一类; 而全隔与单作处理的大豆根际微生物组成较近, 分布距离相近, 归为另一类。进一步从玉米根际微生物组成看, 无隔、网隔、全隔和单作玉米根际微生物组成分离程度及其表现趋势与大豆相似。其中无隔与网隔处理根际微生物组成多数相叠近, 归成一类, 而全隔与单作玉米根际微生物组成也相近, 可归为另一类。网隔与全隔根际微生物组成存在一个逐渐差异的过渡类型。网隔对无隔处理来说, 其根际微生物组成是个渐进变化的过程, 并向无隔处理贴近的过渡; 后者 (全隔处理) 则向单作处理贴近。可见, 随着根系互作强度增强对根际微生物的组成与功能的影响变得更加明显。
2.5 不同种间根系互作下间作玉米、大豆的根际土壤微生物多样性
表 3 结果显示, 间作大豆根际微生物的 ShannonWiener 指数、Simpson 指数和 McIntosh 指数均表现出无隔最高, 网隔次之, 全隔和单作最低的趋势, 且全隔与单作之间无显著差异; 而 McIntosh 指数无隔与网隔间差异显著 (P<0.05)。间作玉米根际微生物的 Shannon-Wiener 指数和 Simpson 指数也表现出与大豆处理下相同的趋势; McIntosh 指数多数情况下, 无隔处理最优, 网隔处理次之, 全隔和单作最低。可见, 种间根系互作增强其根际土壤微生物种类的多样性和丰富度。——论文作者：林伟伟1 , 李 娜1 , 陈丽珊2 , 吴则焰1 , 林文雄1** , 沈荔花1**
