分类：医学论文 时间：2021-09-30 热度：181
摘要背景：聚羟基丁酸戊酸共聚酯具有良好的生物相容性及降解性，但具有强疏水性，不利于细胞的黏附、生长、迁移和分化，严重限制了其在骨组织工程领域的应用，因此有必要对其进一步改性。目的：构建聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙/壳聚糖[poly(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate)/calciumsulfatehemihydrate/chitosan，PHBV/CSH/CS]支架，探究其表征、模拟载药释放行为、生物安全性、体外成骨性和抗菌活性。方法：通过熔融沉积技术制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯支架与聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架(半水硫酸钙为聚羟基丁酸戊酸共聚酯用量的20%)，随后将聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架泡在壳聚糖溶液中并烘干，烘干后的支架放入超纯水中形成壳聚糖水凝胶并复合在支架表面上，制备PHBV/CSH/CS支架。观察3种支架的表面形貌、细胞黏附、细胞增殖情况;测试PHBV/CSH/CS支架的溶胀行为和模拟载药释放行为;利用茜素红染色评估3种支架的成骨性能;利用涂布平板法观察各组支架对标准金黄色葡萄球菌、标准大肠杆菌、临床金黄色葡萄球菌、临床大肠杆菌的抗菌能力。结果与结论：①所制备支架具有均匀且互连的多孔立体结构，平均孔径约为400μm，孔隙率为60%;②PHBV/CSH/CS支架溶胀率达56%，当使用牛血清白蛋白作为模型药物时，PHBV/CSH/CS支架载药率在1h时达57.9%，6h累计释放达56.5%;③聚羟基丁酸戊酸共聚酯支架不利于细胞黏附，聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架改善了细胞黏附，PHBV/CSH/CS支架显著提升了细胞黏附;④3种支架均可促进骨髓间充质干细胞增殖，3组均无明显细胞毒性;⑤茜素红染色实验表明，PHBV/CSH/CS支架对于骨髓间充质干细胞矿化结节的形成作用较另外两支架强;⑥体外抗菌实验表明，PHBV/CSH/CS支架对标准金黄色葡萄球菌、标准大肠杆菌、临床金黄色葡萄球菌、临床大肠杆菌的抑制能力显著强于聚羟基丁酸戊酸共聚酯、PHBV/CSH支架(P<0.01);⑦结果表明，相较于其他支架，PHBV/CSH/CS展现出更好的细胞黏附、成骨、抗菌性能和载药潜能。
关键词：3D打印;聚羟基丁酸戊酸共聚酯;半水硫酸钙;壳聚糖;水凝胶;生物相容性;抗菌活性
0引言Introduction
全球每年因骨肿瘤、创伤、先天、感染等原因造成的骨缺损约200万病例，严重影响患者正常骨骼功能的发挥[1]，目前，临床上通常采用在骨缺损部位植入骨移植物或骨替代材料进行治疗。近年来，3D打印技术在设计和制造用于骨再生的多孔支架方面显示出明显优势，3D打印支架可以获得相互连接的多孔结构和稳定的机械性能，以模仿天然的人类骨骼[2]。近年来，各种材料包括高分子聚合物、金属、生物陶瓷已被广泛用于3D打印支架[3]。在这些材料中，聚羟基丁酸戊酸共聚酯作为一种新型的高分子生物聚酯具有良好的生物相容性及降解性，并呈现出优异的材料改性，近年来在组织工程领域的展现出良好的应用前景[4-6]。但是，同其他聚酯类高分子材料一样，聚羟基丁酸戊酸共聚酯也有一些突出的缺点，包括较弱的机械性能、较低的热稳定性及强疏水性，这些限制了其在骨组织工程的进一步应用[7]。为了克服这些缺点，BIAZAR等[8]将羟基磷灰石掺入聚羟基丁酸戊酸共聚酯支架中用以增强骨再生。
尽管在高分子聚合物中掺入无机材料显示出修复骨的应用潜力，但仍需要进一步改性以提升支架的生物学性能(例如细胞黏附、抗菌等)。水凝胶是一种高分子交联聚合物，具有极强的亲水性，能够吸收大量的水并在水中溶胀，并且可以保持3D网络结构而不溶于水[9]。天然聚合物水凝胶如海藻酸盐[10]、壳聚糖[11]、透明质酸等显示出良好的生物相容性[12]、吸水能力、扩散特性和可调节的生物降解性。与合成水凝胶相比，以壳聚糖为代表的天然聚合物水凝胶不需要使用有毒的交联剂，并且提供了促进细胞功能(如黏附和增殖)的细胞外基质样微环境[13]。此外，壳聚糖早在1979年便被报道具有广谱抗菌性，因此壳聚糖抗菌水凝胶在医用领域展现出极大的应用潜力[14-15]。不仅如此，壳聚糖水凝胶由于能够在特定目标区域连续释放药物而被广泛应用于药物递送领域[16]，生物相容性好、性能稳定、制备方法简单、易于消毒等诸多优点使其成为优良的药物输送载体之一[17]。然而，水凝胶的主要缺点是机械强度低，这限制了其在临床实践中的应用，尤其是骨修复[18]。因此，在3D打印支架表面复合壳聚糖水凝胶可能是同时实现增强水凝胶机械强度和3D打印支架生物功能的明智策略。
为了实现这一目标，在前期基础上使用熔融沉积成型技术制备了具有相互连接的多孔结构和良好机械性能的3D打印聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架[19]，然后将支架浸入壳聚糖溶液中，将壳聚糖水凝胶复合在支架表面上，探究聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙/壳聚糖[poly(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate)/calciumsulfatehemihydrate/chitosan，PHBV/CSH/CS]的表征、模拟载药释放行为、生物安全性、体外成骨性和抗菌活性，以期作为理想的抗菌骨生物材料应用于骨缺损部位。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计支架制备、表征和细胞学实验，单因素方差分析。
1.2时间及地点实验于2017年3月至2018年2月在广州中医药大学完成。
1.3材料
1.3.1支架材料聚羟基丁酸戊酸共聚酯(Y1000P，宁波天安生物材料有限公司，中国);半水硫酸钙(实验室自制);壳聚糖(脱乙酰度：75%-85%;分子质量：50-190kD;黏度：20–300cP，Sigma公司，美国)。
1.3.2主要仪器和试剂3D打印机(Prusai3，广东机电职业技术学院，中国);双螺杆挤出机(SHJ-30，南京杰思特机电公司，中国);微型注射机(SZS-15，武汉瑞鸣塑料机械制造公司，中国);电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9146A，上海精宏实验设备有限公司，中国);超净工作台(JSM-IT300，苏州安泰空气技术有限公司，中国);超净工作台(细菌实验用)(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司，中国);倒置相差显微镜(CKX31，Olympus公司，日本);CO2恒温培养箱(Forma-3111，ThermoScientific公司，美国);台式离心机(4200，KUBOTA公司，日本);多动能酶标仪(MultiskanGO，ThermoScientific公司，美国);生化培养箱(LRH-150B，广东省医疗器械厂，中国);回旋式气浴恒温振荡器(ZD-85A，科析仪器公司，中国);低温制冷微生物BOD种发芽箱(SPX70BE，广东省医疗器械厂，中国);高分辨扫描电子显微镜(JSM-IT300，尼康公司，日本);CCK-8试剂盒(同仁公司，日本);LB培养基(广东环凯生物科技有限公司，中国);营养琼脂(广东环凯生物科技有限公司，中国);成骨诱导液(赛业生物科技有限公司，美国)。
1.4实验方法
1.4.1制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙复合材料根据实验室前期制备方法[19]，通过水热-盐溶液法制备半水硫酸钙，随后将聚羟基丁酸戊酸共聚酯颗粒在真空炉中干燥，并与所制备的半水硫酸钙混合(其中半水硫酸钙用量分别为聚羟基丁酸戊酸共聚酯用量的0%和20%)。熔融共混后，形成标准的聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙复合材料，利用双螺杆挤出机制备成标准直径为1.75mm的3D打印丝。
1.4.2制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙和PHBV/CSH/CS支架通过熔融沉积成型技术制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙多孔支架，所用3D打印机如图1A所示。首先使用SolidWorks(DassaultSystemesS.A)设计软件，设计一个直径为10mm、高度为5mm、3D打印丝的直径为400μm且丝间距为400μm的三维圆柱体支架，如图1B所示，3D打印聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架参数设置：喷追尺寸0.4mm，层高0.32mm，填充率50%，填充图案为直线，外圈圈数为3，打印速度30mm/s，首层打印速度25mm/s，喷头温度200℃及热床温度50℃，根据预设参数对聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架进行3D打印直至支架实体成型，如图1C所示。
为了制造PHBV/CSH/CS支架，将已制备成型的聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架泡在壳聚糖溶液中(壳聚糖浓度3%，乙酸浓度1.5%)1h，随后将支架放入烘箱37℃烘干，使得壳聚糖充分涂覆在支架上。随后将支架放入超纯水中，此时壳聚糖水凝胶形成并复合在支架上，制备得PHBV/CSH/CS支架。然后将该支架浸入5%NaOH溶液中30min，以中和乙酸酸性，并使用超纯水反复冲洗支架3次以备用。
1.4.3支架表面形貌与多孔结构各组支架在真空下干燥、喷金后，利用用扫描电镜评估支架的表面形态和孔径。同时利用MicroCT对支架进行观察和评估。
1.4.4PHBV/CSH/CS支架的溶胀行为检测将PHBV/CSH/CS支架浸入PBS中，分别于1，2，3，4，5，6，12，24，72h将支架取出，用干燥滤纸吸干PHBV/CSH/CS支架表面水分，然后称取其质量，直至PHBV/CSH/CS支架质量不再变化，共设置3个平行样。然后利用公式(1)计算溶胀率：
溶胀率(SR)=(mt-ms)/ms×100%(1)
公式(1)中，SR为平衡溶胀率，ms为干燥时PHBV/CSH/CS支架的质量，mt为溶胀时PHBV/CSH/CS支架的质量。
1.4.5PHBV/CSH/CS支架的载药及释放性能
标准曲线绘制：使用牛血清白蛋白作为模拟载药药物，配置质量浓度为1g/L的牛血清白蛋白溶液，取梯度稀释后的牛血清白蛋白溶液50µL加入96孔板，再加入200µL的蛋白定量分析牛血清白蛋白液，随后放入细胞培养箱孵育30min，并于酶标仪562nm处测吸光度值，计算出标准曲线方程Y=1.6949X+0.2448，其中R²=0.9955，线性关系良好。
载药率的测定：将PHBV/CSH/CS支架放入24孔板中，并质量浓度为1g/L的1mL牛血清白蛋白液滴入，1h后将支架取出，并将孔板内剩余的牛血清白蛋白移至1.5mL离心管，并用PBS补足至1mL。随后将吸取50µL补足后的溶液，加入200µL的蛋白定量分析BCA液孵育30min，酶标仪562nm处测吸光度值。将所得吸光度值带入标准曲线计算出液体的载药量，根据公式(2)可得出支架的载药率：
支架载药率(%)=(1–支架溶胀后剩余液体吸光度值)/总蛋白量吸光度值×100%(2)
释放性能的测试：将PHBV/CSH/CS支架放入24孔板中，将质量浓度为50g/L的1mL牛血清白蛋白液滴入，浸润支架1h后取出，随后放入PBS中，于0.5，1，2，3，4，5，6，12，24，48，72h不同时间点吸取50µL的溶液，加入200µL的BCA液孵育30min，酶标仪562nm处测吸光度值。将所得吸光度值带入标准曲线，计算出牛血清白蛋白的累积释放率。
1.4.6支架细胞相容性评估
细胞培养：将SD大鼠骨髓间充质干细胞(RASMX-01001，赛业生物科技有限公司，中国)常规复苏、离心，将离心管内的骨髓间充质干细胞悬液接种至25cm²细胞培养瓶，细胞浓度为1×107L-1，并加入低糖培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素及链霉素)，随后放入细胞培养箱(体积分数5%CO2，37℃)中培养，隔天更换培养基。
细胞黏附实验：每次使用前将各组支架放入体积分数75%乙醇中灭菌2h，将消毒后的聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙、PHBV/CSH/CS支架置入24孔细胞培养板中。将细胞浓度为2×107L-1的骨髓间充质干细胞悬液接种至上述支架材料，每孔接种500μL，置于细胞培养箱中(37℃，体积分数5%CO2)培养24h。然后在4℃下用2.5%戊二醛固定4h，并使用不同浓度的乙醇梯度脱水，并在叔丁醇中干燥。将支架在真空下干燥，喷金，通过扫描电镜观察附着在支架表面的骨髓间充质干细胞形态特征。
细胞增殖实验：将消毒后的聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙、PHBV/CSH/CS支架置入24孔细胞培养板中，每组3个平行孔。将细胞浓度为2×107L-1的骨髓间充质干细胞悬液接种至上述含支架材料的细胞培养板中，每孔600μL。1，3，5d后每组取3个孔，加入60μL(培养基与CCK-8试剂比为10∶1)的CCK-8试剂，细胞培养箱孵育2h，待孵育时间结束取出细胞培养板，用移液枪吸取每孔200μL溶液至96孔板。然后设置酶标仪波长为450nm测其吸光度值，每孔重复测量3次，取平均值作为最终结果。
1.4.7支架材料成骨性能评估将消毒后的聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙、PHBV/CSH/CS支架置入24孔细胞培养板中。将细胞浓度为1×107L-1的骨髓间充质干细胞悬液接种至上述支架材料，每孔500μL。培养24h待细胞贴壁后，更换含有成骨诱导成分的细胞培养液进行成骨诱导培养，隔天换液。待培养至14d后终止培养。将24孔内的支架取出，PBS洗2遍后，每孔加入500μL的40g/L多聚甲醛固定20min，弃固定液ddH2O洗3遍，每孔加入200μL茜素红S染色液染色30min，弃染料并用ddH2O洗3遍，置于倒置显微镜下观察拍照。
1.4.8支架材料抗菌性能评估
细菌培养：分别取冻存在广州中医药大学第五临床医学院检验科-80℃冰箱里的标准金黄色葡萄球菌、标准大肠肝菌、临床金黄色葡萄球菌及临床大肠杆菌放入无菌台，使用接种环在无菌操作下挑取少量菌液，然后按照四区接种法将细菌按4个不同面积的区域接种到血平板上;将划线后的血平板倒置放入37℃生化培养箱培养24h。24h后，从血平板中分离单克隆纯种细菌;向分离至试管内的细菌加入5mLLB培养基，并将其放至摇床(150r/min，37℃)培养6h。随后取50µL菌液加入至5mLLB培养基中(按1∶100比例)，放至摇床(150r/min，37℃)培养24h，隔天得到传代后的细菌;将传代后的细菌用麦氏比浊法稀释成浓度为1×108CFU/mL的实验用菌液。
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涂布平板法涂板：将4种菌液的浓度稀释至1×105CFU/mL，然后将消毒后的3种支架放入24孔板中，并在每个孔板中分别加入1mL浓度为1×105CFU/mL的各种菌液，每组设置3个平行样，同时设置3个完全空白孔作为对照组。将各组放入温度为37℃的生化培养箱内培养12h;12h后，将孔板内的各组培养液梯度稀释500倍用于涂布平板。先用无菌吸管吸取稀释好的0.1mL菌液对号接种于营养琼脂平板上，并将菌液在平板上涂布均匀，然后置于的恒温箱中培养24h，根据公式(3)计算各组营养琼脂平板上的菌落数：
抗菌率(%)=(N对照–N支架)/N对照×100%(3)
公式(3)中，N对照是对照样品中的平均细菌数量(CFU/样本)，N支架是抗菌实验样品中的平均细菌数量(CFU/样品)。
1.5主要观察指标各组支架的表面形貌、孔径、孔隙率及溶胀率，细胞体外相容性与抗菌性。
1.6统计学分析所得实验数据以x-±s表示，样本量以n表示，数据使用SPSS25.0进行数据分析。若方差齐，采用单因素方差分析(onewayANOVAtest);若方差不齐，则采用多重比较法(Dunnett´sT3)进行分析。假设检验为双重检验，检验水平为P=0.05，当P>0.05表示差异无显著性意义，P<0.05表示差异有显著性意义，P<0.01表示差异有非常显著性意义。
2结果Results
2.1各组支架的表面形貌使用纯聚羟基丁酸戊酸共聚酯所打印的支架表面较为光滑，并且支架本身具有较大的孔径，平均孔径达到了约400µm，大孔经为水凝胶浸渍并形成相互连接的结构提供了足够的空间;聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架表面相对粗糙，且半水硫酸钙在其中开始有少量的团聚体出现;将聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架浸泡在壳聚糖溶液后，经过烘干，壳聚糖紧紧地复合在聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架表面，如图2所示。通过Micro-CT观察支架并对其进行三维重建后进行分析，可得通过计算得出聚羟基丁酸戊酸共聚酯支架的孔隙率为(59.25±2.68)%，连通性为(99.97±0.02)%，平均孔径为(400.65±38.58)µm。这说明支架具有较高的孔隙率、良好的孔隙分布及较大的孔径尺寸。
2.2PHBV/CSH/CS支架溶胀行为的检测溶胀性能是反映水凝胶吸水性能的重要指标，可以评估水凝胶潜在的药物递送能力。如图3所示，PHBV/CSH/CS支架可以在37℃和pH值为7.4的PBS中快速溶胀，说明复合在聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架表面的壳聚糖水凝胶具有良好的吸水性能。从溶胀曲线图可以看出，PHBV/CSH/CS支架在1h时便可达到一个较高溶胀率，为52%，此后支架的溶胀率则保持在一个相对稳定的水平，72h后溶胀率为56%，增长并不显著。实验结果表明，PHBV/CSH/CS支架拥有良好的溶胀性能，并且性质稳定，可以在溶液中保持较长时间水分。
2.3PHBV/CSH/CS支架载药及释放性能测试根据公式(2)可以计算得出PHBV/CSH/CS支架的载药率为57.9%，载药率较高，是一个良好的药物载体。从图4可以看出，PHBV/CSH/CS支架具有一定的缓释功能，最初6h释放较快，累计达到56.5%，属于突释阶段，随后趋于平缓，至72h时累计已释放71%。实验结果表明，所制备的PHBV/CSH/CS支架对牛血清白蛋白具有一定的缓释作用，有成为药物递送载体的潜力。
2.4各组支架对细胞黏附行为的影响见图5。
通过扫描电镜评估材料表面对细胞的黏附性能。如图5A显示，单纯的聚羟基丁酸戊酸共聚酯支架表面未见细胞黏附，这说明单纯的聚羟基丁酸戊酸共聚酯支架细胞黏附性能不佳。
图5B可见散落在聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架上的细胞。通过放大扫描电镜倍数，如图5E所示，骨髓间充质干细胞丝状伪足数量较少，并且没有完全伸展。图5C显示出PHBV/CSH/CS支架上分布有较多成群骨髓间充质干细胞(见图中红箭头所示)，细胞呈梭形且伸展良好，细胞紧密黏附在材料表面。放大扫描电镜显示，图5F细胞丝状伪足清晰可见。这说明PHBV/CSH/CS支架不仅具有良好的生物相容性，而且显著提高支架表面的细胞黏附能力。
2.5各组支架对细胞增殖的影响图6结果显示骨髓间充质干细胞在3组支架培养不同时间点的细胞增殖过程。可以看到，骨髓间充质干细胞在各组支架表面都有明显增殖，这说明各组支架对细胞均无毒性。培养第5，7天时，骨髓间充质干细胞在PHBV/CSH/CS支架上的增殖速率相较于聚羟基丁酸戊酸共聚酯和聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架有一定提高(P<0.05)。该结果体现出PHBV/CSH/CS支架表面具有更好的生物活性和细胞亲和力，有利于细胞的增殖，这与细胞黏附的实验结果相一致。
2.6各组支架对细胞成骨性能的影响矿化结节是评价材料促进成骨分化的一个重要标准，通过进行茜素红染色可以反映出细胞矿化结节的程度[20]。各组成骨诱导培养14d后，聚羟基丁酸戊酸共聚酯组形成了少量的矿化结节，聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙组形成较多的矿化结节，PHBV/CSH/CS组形成的矿化结节最多，见图7。结果表明，3组支架材料均能促进骨髓间充质干细胞矿化结节的产生，从而促进成骨分化，且PHBV/CSH/CS组促进矿化结节形成的作用强于另外两组，而聚羟基丁酸戊酸共聚酯组则相对最弱。
2.7各组支架对标准金黄色葡萄球菌的抗菌性能图8反映了各组支架对标准金黄色葡萄球菌的抗菌活性。聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架和对照组之间没有明显差异(P>0.05)，这说明聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架对标准金黄色葡萄球菌没有任何抗菌活性。而PHBV/CSH/CS支架抗菌能力显著高于聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架(P<0.01)，通过计算表明，PHBV/CSH/CS支架对标准金黄色葡萄球菌的抗菌率达到(98.78±1.07)%，说明PHBV/CSH/CS支架对标准金黄色葡萄球菌表现出良好的抗菌活性。
2.8各组支架对标准大肠杆菌的抗菌性能图9反映了各组支架对标准大肠杆菌的抗菌活性。聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架和对照组之间没有明显差异(P>0.05)，这说明聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架对标准大肠杆菌没有任何抗菌活性。PHBV/CSH/CS支架的抗菌能力显著高于聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架(P<0.01)，通过计算表明PHBV/CSH/CS对标准大肠杆菌的抗菌率达到(98.64±0.91)%，说明PHBV/CSH/CS支架对标准大肠杆菌表现出良好的抗菌活性。——论文作者：叶翔凌1，夏远军2，王波群3，康正阳4，吴斌4
文章名称：益脑心颗粒制备中7个活性成分转移率的研究
