分类：医学论文 时间：2021-09-30 热度：184
摘要目的：建立注射用头孢米诺钠的有关物质测定方法，并进行验证。方法：色谱条件：选用反相色谱柱;流动相为冰乙酸水溶液(1→100)-甲醇-四氢呋喃(990∶5∶5)，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，检测波长为254nm。主峰保留时间约为19.6min，杂质1～5的保留时间分别约为：4.6、8.8、25.8、12.1、10.2min。筛选色谱柱并优化稀释剂。验证方法的专属性、准确度、重复性、定量限与检测限、线性及范围，并计算出各有关物质的校正因子。采用该方法检测了2个规格共6批注射用头孢米诺钠。结果：最适合的色谱柱型号：AgilentZorbaxSB-Aq，250mm×4.6mm，5μm;稀释剂为水-甲醇-四氢呋喃(990∶5∶5);方法专属性良好，准确度、精密度均满足要求;根据定量限与检测限及线性，确定了主物质及各杂质的浓度范围，进而得出各杂质的校正因子;杂质1～5的校正因子分别为：2.73，0.32，1.05，1.21及1.15;6批供试品的有关物质检测结果均符合质量标准的规定。结论:成功建立了检测注射用头孢米诺钠中的有关物质的HPLC方法，该方法具有良好的专属性、准确度、重复性、线性范围。
关键词注射用头孢米诺钠;物质;HPLC
注射用头孢米诺钠(CefminoxSodiumforinjec-tion)其处方为头孢米诺钠(CefminoxSodium)的无菌粉末，是头霉素衍生物，由半合成法制取。合成工艺由倪福震[1]总结王浩等采用了以7-MAC为原料的合成工艺路线[2]，分别经历了7-MAC的酰化，脱羧酸保护基，与D-半胱氨酸盐酸盐水合物的缩合制成粗品，重结晶精制;吴志军等[3]以7-ACA为原料，经历4步合成得到粗品，然后精制而成。头孢米诺钠其性质类似于第三代抗生素，具有抗β-内酰胺酶的作用，体内分布广泛，血药浓度达峰时间快，几乎无不良反应，所以，此品种市场竞争力较大[4-6]。头孢米诺钠目前收载于中国药典(CP)、日本药典(JP)以及相关企业注册标准及内控标准中，品种分别为原料和注射剂。《中国药典》2020年版二部(308页)收载了原料药头孢米诺钠及其制剂注射用头孢米诺钠，有关物质Ⅰ方法质量标准限度中没有订出已知杂质。《日本抗生物质医药品基准解说》中也没有对头孢米诺进行已知杂质标准的制定，所以本文通过对工艺及降解途径的研究，得出潜在已知杂质，然后建立反相HPLC方法，并对方法进行验证[7-8]。然后对6批样品进行有关物质的检测。
1材料与方法
有关物质信息，笔者研究了头孢米诺钠的工艺及降解途径，得出了5个潜在杂质。其中，杂质1、5为工艺杂质，杂质2、3、4为降解杂质。主成分及各杂质信息见表1。
其中，杂质1与杂质5为工艺杂质，杂质2为主成分3位侧链水解产物，杂质3为δ-2位异构化变为δ-3的产物，杂质4为主成分4位侧链降解后与溶剂结合产物。笔者得到了各杂质对照品，以《中国药典》2020年版二部头孢米诺钠项下的有关物质方法为基础，筛选条件，建立方法。
1.1供试品与对照品注射用头孢米诺钠(韩国Kukje公司，批号：MMX11918X，MMX11919X，MMX11920X，MMX21910X，MMX21911X，MMX21912X);头孢米诺对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130508-201604);头孢米诺系统适用性对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130607-201802);头孢米诺杂质1(商业定制);头孢米诺杂质2(商业定制);头孢米诺杂质3(商业定制);头孢米诺杂质4(商业定制);头孢米诺杂质5(商业定制)。
1.2仪器与试剂安捷伦1260液相色谱仪，Open-lab2.3CDS工作站;赛多利斯BT125D十万分之一天平;赛多利斯MSA3.6P百万分之一天平;布兰德电子移液枪;甲醇(色谱纯)、四氢呋喃(色谱纯)，冰乙酸(分析纯)。
1.3方法的优化
1.3.1《中国药典》2020年版色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以醋酸溶液(1→100)-甲醇-四氢呋喃(990∶5∶5)为流动相;检测波长为254nm;进样体积10μL。
1.3.2色谱柱筛选按照限度浓度配制主物质与各杂质的混合溶液作为定位溶液(取供试品及各杂质对照品稀释并溶解制成每1mL约含头孢米诺1.0mg，各杂质2μg的溶液)，分别选用安捷伦公司的ZorbaxXDB-C18，250mm×4.6mm，5μm;ZorbaxSB-Aq，250mm×4.6mm，5μm;ZorbaxSB-C18，250mm×4.6mm，5μm3根色谱柱进样。
1.3.3杂质稳定性考察取上述定位溶液，连续进样6次，计算各杂质峰面积的RSD%。
1.3.4稀释剂的优化将稀释剂由醋酸溶液(1→100)-甲醇-四氢呋喃(990∶5∶5)改为水-甲醇-四氢呋喃(990∶5∶5)，按照定位溶液配制方式，连续进样6次，计算各杂质峰面积的RSD%。
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1.3.5方法的建立稀释剂为水-甲醇-四氢呋喃(990∶5∶5)。取本品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1mL中约含头孢米诺1.0mg的溶液，作为供试品溶液(临用新制)。精密量取适量，用稀释剂定量稀释制成每1mL中约含头孢米诺10μg的溶液，作为对照溶液;精密量取对照溶液1mL，用稀释剂定量稀释制成每1mL中约含头孢米诺0.5μg的溶液，作为灵敏度溶液。色谱条件为：选用反相色谱柱(AgilentZorbaxSB-Aq，250mm×4.6mm，5μm);流动相为冰乙酸水溶液(1→100)-甲醇-四氢呋喃(990:5:5)，稀释剂为水-甲醇-四氢呋喃(990:5:5)，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，检测波长为254nm。取灵敏度溶液注入液相色谱仪，主成分峰高的信噪比应大于10。取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间约3倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，杂质1、2、3、4、5的峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.2%)，其他单个未知杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.2%);各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(1.5%)。
1.3.6方法的验证
1.3.6.1对照品贮备液的配制：取头孢米诺对照品及各杂质对照品适量至不同量瓶中，精密称定，分别制成100μg/mL的溶液。
1.3.6.2专属性：取供试品适量，精密称定，分别精密移取各杂质对照品贮备液至此量瓶中，用稀释剂稀释溶解制成含头孢米诺钠1mg/mL，各杂质2μg/mL的溶液。将此溶液注入色谱仪，记录色谱图，测定所有色谱峰之间的分离度。
1.3.6.3准确度:标准品溶液：精密量取各杂质对照品贮备液至同一量瓶中，稀释制成各杂质2μg/mL的溶液;未加标溶液：取供试品适量，精密称定，溶解并稀释制成含头孢米诺钠1mg/mL的溶液;加标溶液：分别制备50%、100%、150%水平加标溶液：取供试品适量，精密称定，分别精密移取各杂质对照品贮备液至此量瓶中，用稀释剂稀释溶解制成含头孢米诺钠1mg/mL，各杂质1、2、3μg/mL的溶液。分别将各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。计算各加标溶液的回收率及回收率的RSD%，回收率的范围均应在90%～108%，RSD%应不大于3。
1.3.6.4重复性:标准品溶液、未加标溶液、100%水平加标溶液的配制方式同1.3.6.3准确度项下。分别将各溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。计算各加标溶液的回收率的RSD%，RSD%应不大于3。
1.3.6.5定量限与检测限：逐级稀释各杂质对照品贮备液至同一量瓶中，注入色谱仪，记录色谱图。定量限混合溶液中，各物质的峰高的信噪比均应不小于10;检测限混合溶液中，各物质的峰高的信噪比均应在3～10。
1.3.6.6线性与范围：精密移取各贮备液至同一量瓶中，分别稀释制成含各物质6、4、3、2、1.6、1μg/mL的溶液(线性级别分别为：300%、200%、150%、100%、80%、50%)，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，得到浓度下的各物质峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程，计算相关系数R值。
1.3.6.7校正因子：将得到的1.3.6.6项下的各杂质标准曲线的斜率分别除以头孢米诺标准曲线的斜率，即得到各杂质的校正因子。
1.3.6.8耐用性：分别使用以下色谱条件进样标准品溶液、未加标溶液、100%水平加标溶液：柱温分别为25℃、35℃;流速分别为0.9、1.1mL/min，检测波长252、256nm。各耐用性条件下各杂质含量按外标法计算，均应不大于2%。1.3.6.9样品检测：用建立并完成验证的方法检测6批供试品有关物质，计算各杂质含量。
2结果
2.1方法优化结果
2.1.1色谱柱筛选使用色谱柱1、2，杂质4、5分离度均小于1，色谱图中，两峰未分开，使用色谱柱3，各杂质均能良好分离，最小分离度为1.3。图略。
2.1.2杂质稳定性考察各杂质峰峰面积的RSD结果如表2所示。杂质2峰面积的RSD%>2。
2.1.3稀释剂的优化笔者尝试不含乙酸的稀释剂，即：水-甲醇-四氢呋喃(990∶5∶5)。各杂质峰峰面积的RSD结果如表3所示。各杂质峰面积的RSD%均<2，本研究使用此稀释剂。
2.2方法的验证
2.2.1专属性所得色谱图及各色谱峰之间的分离度结果如表4、图1所示。所有峰之间的分离度均大于1.2，专属性良好。
2.2.2准确度各加标溶液的回收率及RSD%如表5所示。所有杂质回收率均在90%～108%，回收率RSD%均小于3，均符合规定。
2.2.3重复性各100%加标溶液中，杂质1、2、3、4、5的回收率的RSD%分别为1.832、0.472、0.724、0.484、0.654，均小于3，符合规定。
2.2.4定量限与检测限当各杂质峰高信噪比约为10时，头孢米诺、杂质1、2、3、4、5浓度分别为0.103、0.123、0.016、0.129、0.081、0.060μg/mL，即为方法的定量限;当各杂质峰高信噪比约为3时，头孢米诺、杂质1、2、3、4、5浓度分别为0.041、0.049、0.007、0.052、0.033、0.024μg/mL，即为方法的检测限。
2.2.5线性与范围、校正因子头孢米诺及各杂质的线性及范围结果为：头孢米诺在0.10～6.20μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=9.5232X-0.1733，R2=1.0000;杂质1在0.05～6.23μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=3.4796X-0.3555，R2=0.9991，校正因子为2.73;杂质2在0.01～6.82μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=29.9090X-0.8581，R2=0.9999，校正因子为0.32;杂质3在0.09～6.78μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=9.0687X-0.2849，R2=0.9999，校正因子为1.05;杂质4在0.05～6.13μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=7.8471X-0.1413，R2=1.0000，校正因子为1.21;杂质5在0.05～6.84μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=8.2861X-0.1786，R2=0.9999，校正因子为1.15。
2.2.6耐用性各耐用性条件下，均有杂质含量变化超过2%，更换条件均不能满足耐用性要求。此方法应严格按照方法进行。各耐用性条件下各杂质含量变化如表6所示。
2.2.7样品检测6批样品检测结果如表7所示。其结果均满足质量标准的要求。
3讨论
本研究建立了注射用头孢米诺钠中的有关物质的HPLC检测方法，以《中国药典》中头孢米诺钠项下的质量标准为基础，根据各杂质的性质筛选了反相色谱柱及稀释剂条件，其中筛选色谱柱使得各物质的分离度符合要求，筛选稀释剂增加了杂质的稳定性，使得方法验证能顺利进行。然后对此方法进行了方法验证，验证结果表明，该方法具有良好的专属性、准确度、重复性、线性范围，并计算出了各杂质的校正因子，方法需严格按照标准进行。最后检测了6个批次的样品，结果均符合质量标准的要求。综上，本方法成功建立，能准确检测本公司的样品。——论文作者：于涵光1，2，徐亮1
