分类：农业论文 时间：2021-09-06 热度：127
摘要：为了选育海巴戟(Morindacitrifolia)抗寒株系，拓宽种植范围,在云南元江选择8株海巴戟，采用石蜡切片法观察叶片解剖结构，并测量叶片的过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，对抗寒株系的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)活性和GPAT表达进行定量分析。结果表明，叶片解剖结构表明有4株海巴戟叶片的栅海比较高，细胞结构紧密，确定为抗寒性优良的候选株系(5、6、8和12号)。5号植株叶片经低温处理后的CAT、POD、SOD活性较高，MDA含量较低，确定为抗寒株系，且低温处理后5号植株叶片的GPAT活性和GPAT基因表达水平均高于不抗寒材料。因此，海巴戟叶片通过增加栅海比和细胞结构紧密度，同时GPAT基因迅速应答来提高抗寒性。
关键词：海巴戟;抗寒性;解剖结构;甘油-3-磷酸酰基转移酶
海巴戟(Morindacitrifolia)，又称诺丽(英文Noni的音译)，是典型的热带植物，具有广泛的营养和药用价值，具有抗氧化、消炎抑菌、增强免疫力、保护肝脏和心血管等功能[1]，适宜在年均温21℃~27℃的无霜区种植，不耐低温，当温度低于5℃时，叶片开始发黄，若温度持续降低叶片则发黑褐化，甚至植株脱水死亡[2]。近年来，极端气温频发，严重影响了海巴戟产业，因此选育抗寒株系，增加温度适应性，扩大种植范围已成为其推广的瓶颈问题。已有研究表明，叶片的形状、厚度及其解剖结构可作为植物抗寒性的主要评价指标[3]，叶片性状在香蕉(Musaspp.)[4]、可可(Theobromacacao)[5]、油棕(Elaeisguineensis)[6]等热带植物的抗寒性研究中占有重要地位，也筛选出一批抗寒性强的材料。抗寒性强的植物抗氧化酶活性较高[7]，过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等在抗寒性较强的植物中能够快速响应，而在抗寒性弱的植物中则缓慢合成[8–9]。植物的抗寒能力与叶绿体膜脂中顺式不饱和脂肪酸磷脂酰甘油的水平密切相关[10]，甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphateacyltransferase,GPAT)是磷脂酰甘油生物合成过程中的第一个酰基转移酶[11]，且在水稻(Oryzasativa)的研究中表明GPAT的表达水平与抗寒性有直接联系[12–13]。
海巴戟原产于南太平洋岛屿，不耐寒，引种到我国云南热区后，虽能基本适应当地的气候条件，但云南热区近年来频发的低温对海巴戟植株造成严重伤害。2015年12月，云南元江遭遇5℃的极端低温，在海巴戟种植基地的海巴戟有的出现寒害现象，也有的正常生长(图1:A)，发生寒害的植株地上部分枯死，在温度恢复后，经台刈可以在数月后萌发新枝(图1:B,C)，暗示海巴戟对寒害有较积极的响应机制。本研究以自然寒害发生后，在云南元江海巴戟种植基地中选择8株抗寒海巴戟进行研究，通过石蜡切片观察叶片解剖结构，测量叶片的CAT、POD、SOD、GPAT活性和丙二醛(MDA)含量及GPAT基因表达，以确定抗寒株系并分析其抗寒机理。
1材料和方法
1.1采样和样品处理
2017年5月，在云南省玉溪市元江县海巴戟种植基地选择12株海巴戟(Morindacitrifolia)并编号，其中4株(No.1~4)为2015年冬季发生寒害后地上部分枯死、台刈后又发出新枝的植株，另8株为未受寒害影响植株(No.5~12)。
1.2叶片形态解剖观察
每株取无病虫害、健康的成熟叶片10片，剪切成0.5cm×0.5cm的小块，投入FAA固定液中固定，带回实验室抽真空2h，制成石蜡切片，在NikonEclipseCI显微镜下观察并拍照，放大倍数为200倍，用Image-ProPlus6.0(MediaCybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)软件测量各组织厚度，每张切片随机挑选至少3个视野进行拍照，每视野每个指标随机测量10次，共30个测量值，取平均值，计算叶片紧密度(CTR)、疏松度(SR)和栅海比(P/S)[14]，栅海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度;CTR%=栅栏组织厚度/叶片厚度×100%;SR%=海绵组织厚度/叶片厚度×100%。
1.3低温处理
取海巴戟植株中上部、位于向阳面无病虫害、整齐均匀的成熟叶片，用保鲜盒包好带回实验室，放入5℃冰箱进行低温处理。分别于0、2、12、24、48h进行取样，液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。
1.4抗寒生理指标测定
CAT、POD、SOD活性和MDA含量均按照苏州格锐思生物科技公司的试剂盒说明书测定，用紫外分光光度计(ThermoscientificEvolution201,USA)测定相应波长下的吸光值。3次重复。
1.5GPAT活性测定
GPAT活性按照植物甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)ELISA试剂盒(武汉酶免生物科技有限公司)说明书在酶标仪(TecanAustriaGmbH5082Grodig,Austria)上测定。
1.6GPAT表达分析
从本课题组前期海巴戟3代转录组测序结果(登录号：SRR12716286)中查找到2个GPAT基因GPAT4和GPAT9，设计qPCR引物(GPAT4F:3ʹ-GGAAGAACCGGCCTAGAGAC-5ʹ和GPAT4R:3ʹ-GGCTCTCTGGATGACTCCCA-5ʹ;GPAT9F:3ʹ-TCTAAAGGCTGGTGAGACGC-5ʹ和GPAT9R:3ʹ-TGCTTAGGGCTAGGACGTGA-5ʹ)，以海巴戟β-actin为内参基因[15]，用荧光定量仪(RocheLightCycler480,Swit)分析GPAT基因的表达情况，以2-△△CT计算表达量。
1.7数据统计分析
所有数据用Excel2010进行整理，用SPSS22.0对数据进行统计分析，采用单因素方差分析(P<0.05)数据的差异性。
2结果和分析
2.1叶片的解剖结构
对海巴戟植株叶片进行解剖观察(图2)，可见叶肉具有明显的栅栏组织和海绵组织，属于典型的异面叶。叶片横切面构造类似，上表皮均由排列紧密的单层细胞组成，无气孔;其下是整齐而紧密的栅栏组织，细胞呈长柱形，由1~2层细胞组成;栅栏组织下面为排列疏松多孔的海绵组织，细胞多为不规则球形;下表皮也由单层细胞组成，下表皮分布有气孔。
栅海比不同抗寒性的海巴戟叶片中的栅海比(P/S)差异显著(图3)。No.5的P/S最大，达0.69，与No.6、No.8和No.12的差异不显著，但与其余8株的差异显著(P<0.05);No.1的最小，为0.42，与No.2的差异不显著，与其余10株的差异均达显著水平(P<0.05)。
紧密度海巴戟叶片结构的紧密度(CTR)差异达显著水平(图3)。No.5的CTR最大，达32.69%，与No.3~4、No.6和No.8~12的差异不显著，而与其余3株的差异显著(P<0.05);No.1的最小，为21.55%，与No.2和No.7的差异不显著，与其余9株的差异显著(P<0.05)。
疏松度海巴戟叶片结构疏松度(SR)的差异显著(图3)。No.2的SR最大，达54.16%，与No.3和No.9的差异不显著，而与其余9株的差异显著(P<0.05)。No.5的最小，为47.54%，与其余11株的差异显著(P<0.05)。
从叶片解剖结构来看，初步选择No.5、No.6、No.8和No.12号为抗寒性优良的候选材料，而No.1和No.2的抗寒性最差，与田间观察结果一致。
2.2低温对抗氧化能力的影响
低温胁迫下12株海巴戟叶片的CAT活性差异显著(图4)，以No.5的最高，与其余11株的差异显著;其次是No.8、No.11和No.12;不抗寒的No.1号最低。低温处理下12株海巴戟叶片的POD活性差异显著(图4)，以No.8的最高，与其余11株的差异显著;其次是No.6、No.5和No.11;No.1的最低。可见，No.5抗寒性优良，而No.1不抗寒，No.7的抗寒性一般，可作为对照材料，开展后续试验。
2.3低温处理时间对抗氧化能力的影响
低温处理对抗寒性不同的海巴戟叶片的CAT、POD和SOD活性及MDA含量影响差异显著(图5)。抗寒的No.5叶片CAT活性随低温处理时间延长始终处于较高的水平，与另2株的差异显著。No.1低温处理2和24h的CAT活性低于No.7，差异显著。这说明海巴戟叶片CAT活性对低温的响应速度影响了材料的抗寒性，对低温响应越迅速越抗寒。低温处理2h，抗寒的No.5叶片POD活性最强，此后逐渐降低，说明其遇低温后POD能迅速响应，并保持较高水平;No.1和No.7的POD活性变化趋势与No.5的相似，但活性水平均远低于No.5,说明No.5具有较高的抗氧化活性。抗寒性较好的No.5叶片SOD活性较高，与No.1和No.7有显著差异;不抗寒的No.1叶片SOD活性显著低于另2株，且随低温处理时间的延长SOD活性不断下降;抗寒性一般的No.7叶片SOD活性在低温处理12h内呈直线下降，24h后出现明显增高的趋势。随低温处理时间的延长No.1和No.5叶片的MDA含量曲线呈开口向下的抛物线，均在处理12h时达到最高值，处理48h时降至最低;No.7叶片的MDA含量变化在前期与No.1和No.5一致，但处理48h仍处于较高水平。No.5叶片的MDA含量比No.1和No.7的低，No.1在前期相对较高，No.7则在后期相对较高。
2.4低温处理对GPAT活性的影响
低温处理下，抗寒性不同的海巴戟叶片中GPAT活性差异显著(图6)。No.5叶片的GPAT活性随低温处理时间延长不断上升，在处理前期表现不明显，处理12h后高于另2株;No.1的约呈开口向下的抛物线趋势，处理2h时最高，在处理前期显著高于另2株，后期介于No.5和No.7之间;No.7叶片的GPAT活性变化趋势与No.5一致，但活性较低。
2.5低温处理对GPATs基因表达的影响
以No.1和No.5经低温处理的叶片cDNA为模板进行qPCR分析。从图6可见，随低温处理时间的延长，No.5中的GPAT4相对表达量不断上升;而No.1的呈开口向下的抛物线趋势，处理12h时达到最高。No.5中的GPAT9相对表达量则呈开口向下的抛物线趋势，12h时达到最高，而No.1的呈下降趋势。这表明GPAT4和GPAT9均参与了海巴戟的抗寒反应，GPAT4的表达量与GPAT活性变化趋势基本一致，且表达量持续上升，推测其为海巴戟抗寒反应中的关键基因。
3结论和讨论
3.1叶片解剖结构与抗寒性的关系
植物受到低温胁迫后，其生理生化指标易受环境的改变而发生不同的变化，但形态和解剖结构是特定环境条件下形成的，不会因环境改变而发生较大变化。叶片是植物进化过程中对环境变化反应敏感的器官之一[16]，叶片厚度、气孔密度、栅栏组织/海绵组织比(P/S)等均与抗寒性密切相关[17]。郭学民等对桃树(Amygdaluspersica)叶片解剖结构的研究表明，叶片厚度等在一定程度上可以反映植物抗寒性[18]。有研究表明，植物的抗寒性与细胞紧密度呈正相关，与细胞疏松度呈负相关[19–21]。从本研究的12株海巴戟植株的叶片解剖结构来看，抗寒性好的植株叶片的P/S较大，CTR较高，SR较低，反之则CTR低，SR高。这与前人的研究结果一致。因此，可选用叶片解剖结构作为海巴戟抗寒性鉴定的指标之一。
3.2低温胁迫与GPAT的关系
GPAT是磷脂酰甘油生物合成过程中的第一个酰基转移酶，GPAT对底物酰基具有选择性差异，影响着植物生物膜中PG分子的饱和程度，从而决定植物的抗寒性[22]。GPAT基因对植物抗寒性的影响已得到证实，将拟南芥(Arabidopsisthaliana)的质体GPAT基因的cDNA转入烟草(Nicotianatabacum)[23]和水稻(Oryzasativa)[24]中超表达能提高低温抗性;从番茄(Lycopersiconesculentum)中克隆得到LeGPAT基因，在番茄中超表达LeGPAT基因，提高了抗低温能力[25]。GPAT的相对表达量因植物的不同有很大的差异，随着低温处理时间的延长多呈开口向下的抛物线趋势，峰值出现时间因植物而异[26–28]。本研究中，海巴戟叶片的GPAT9表达量亦呈开口向下的抛物线，而GPAT4的表达与GPAT活性变化趋势一致，随低温处理时间延长持续上升，推测GPAT4基因更可能是海巴戟抗寒过程中的关键基因，后续应进行深入研究。
3.3海巴戟抗寒性研究的意义
海巴戟属于热带植物，主要分布于南太平洋诸岛屿、东南亚等地，我国引种后主要集中在云南西双版纳、元江等热区种植，盛产期后的海巴戟产量可达60000~75000kg/hm2,按目前的收购价4元/kg计算，种植海巴戟可获得可观的经济效益，平均年产值为240000~300000元/hm2，扣除45000元/hm2的成本，种植海巴戟可获得的年收益为195000~255000元/hm2。据统计，海巴戟产品的市场需求以每年约50%的速度增加，是全球最畅销的健康产品之一，因此其市场前景非常广阔，但海巴戟只有在赤道附近的热区才能大量生长繁殖，海巴戟产品一直供不应求[29]。近年来，西双版纳和元江两地极端天气频发，导致大多数海巴戟植株地上部分枯死，虽台刈后可发新枝，但基本能导致当年的产量减半，对海巴戟产业造成了较大的损失。随着海巴戟种植逐渐发展成为云南重要的特色产业，提高温度适应性，扩大种植范围已成为其推广的瓶颈问题。虽然可以采用塑料大棚、温室等一些保护措施，但通过在玉溪、昆明等地的种植表现，保护性栽培导致成本高、果实小且产量低，因此进行抗寒育种工作才是提高其抗寒性的根本措施。目前海巴戟No.5植株作为抗寒株系正在进行扦插繁殖，将在玉溪、昆明等地开展适应性研究。此外，GPAT4基因与提高海巴戟抗寒性密切相关，后续亦可通过基因工程手段提高海巴戟的抗寒性。
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本研究在自然寒害后筛选出海巴戟抗寒株系，且从细胞学、生理生化和分子生物学等层面进行了鉴定。海巴戟抗寒株系通过增加叶片的栅海比和结构紧密度在细胞水平上提高抗寒性，并在寒害发生时通过GPAT基因的迅速应答以提高GPAT活性，降低细胞膜流动性，同时CAT、POD、SOD等保护酶也积极应答以提高植株的抗氧化活性。——论文作者：邹瑞,王青芬,吴田*
文章名称：热带植物海巴戟抗寒株系选育
