分类：医学论文 时间：2021-10-15 热度：277
摘要：微流控技术在医疗分析中具有重要的应用意义。在对样品生物分子分析前通常需要进行分选，达到纯化的目的。使用不同种类的微颗粒代替生物分子(如细胞、蛋白质和DNA等)，可模拟其在海藻酸钠溶液环境中的作用。通过软光刻制备的微流控芯片集成了微颗粒聚焦、液滴包裹微颗粒、液滴减速及液滴颗粒分选4个功能。通过鞘液流使微颗粒聚焦成一行，可有效提高海藻酸钠液滴包裹单颗颗粒的概率，且在分选前通过分流使液滴减速更加易于将目标颗粒精准分选。其中海藻酸钠液滴包裹有单颗颗粒的概率为21%，空液滴的概率为79%。通过电分选技术成功将包裹有荧光微颗粒的液滴从样品中分选出来，分选成功率达到了87%，可为医疗分析提供技术支持，降低医疗检测成本。
关键词：海藻酸钠;微流控技术;微颗粒;液滴;分选;软光刻
0引言
海藻酸盐由于具有生物相容性、低毒性且成本低廉等特点，被广泛应用于生物医学领域。使用海藻酸纳溶液作为生物样品溶剂时，可为样品提供良好的保护环境。对海藻酸钠溶液中的样品进行检测时，为了得到准确的检测结果，通过鞘液流可将检测物在流道中以较为规则的顺序排列。M.R.Bailey等人[1]将鞘液流与表面增强Raman散射和电化学检测技术相结合，实现了对核黄素的检测。孙思帆等人[2]设计了一种基于多个聚焦单元的惯性聚焦和鞘层流体流动聚焦结构的微流控芯片。
海藻酸钠液滴可为样品中的生物分子提供良好的检测环境，同时可为样品反应提供相对可控的平台。针对某一生物分子的检测，需对微液滴进行筛选，从大量液滴中筛选出满足目标的液滴，从而极大地提高了检测效率和准确度。通常对液滴或者颗粒等进行分选的方法可分为主动分选[3]和被动分选[4]。
被动分选不需要外加动力源，一般通过设计较为复杂的微通道结构，使流体在通道内产生扰动，从而对分选目标产生不同的作用力，实现对物体的分选。采用被动式分选虽然不需要外加动力源且能实现高通量，但流道设计较为复杂，且可控性较差。M.Yamada等人[5]通过构造类似筛的网格状微通道，实现了大小颗粒的连续分选，并进行了微颗粒高精度分选的理论分析。申少斐等人[6]设计并制备了一种含过滤区域、惯性聚焦区域、惯性分离区域和空间位阻区域的被动式微流控分选芯片。
主动分选相对于被动分选具有较好的可控性，且可通过改变外加场的参数等实现对不同目标的分选，适用范围较广。主动分选通过施加合适的外加动力源来实现，如电场力和磁场力等。这些外加物理场力将对不同目标产生不一样的作用力，具有同一特征的目标物将迁移到相应位置处，因此达到分选的目的。主动分选的特点使其具有良好的通用性，其中电分选在主动分选系统技术中应用研究较为广泛。J.Dubose等人[7]使用连续流电分选在不对称双螺旋微流道中将相似体积的球形和花生形颗粒分离出来。陶冶[8]通过液滴及介电泳技术实现了高通量颗粒检测与分选。
为了降低在医疗领域中对细胞和蛋白质等生物分子的检测成本，且能够实现对样品进行快速准确的检测，设计并通过软光刻法制备了一种可用于生物样品分析检测的芯片。在海藻酸钠溶液环境中进行实验，且用不同的微颗粒代替生物分子模拟其在环境中的作用。制备的微流控芯片集成了微颗粒聚焦、液滴包裹微颗粒、液滴减速及液滴颗粒分选四个功能。采用鞘液流聚焦微颗粒，能够有效提高液滴包裹单颗颗粒的概率，同时避免液滴包裹多颗颗粒，从而提高检测结果准确度。液滴包裹微颗粒后，通过分流使液滴减速为精确分选不同种类的颗粒液滴打下基础。同时使用荧光信号触发的外加电场，将荧光颗粒液滴在大量液滴中分选出来，从而为筛选检测和生物分子的分析提供了技术支撑。
1实验
1.1芯片设计及制备
微颗粒分选芯片结构设计如图1所示，图中黑色部分为微电极。从左到右，该芯片能够实现对颗粒或液滴的四种不同操作。①微颗粒聚焦。在通有微颗粒的海藻酸钠溶液的主流道两侧设计与主流道夹角为60°的分支流道，从而利用鞘液流使微颗粒聚焦到中间的位置。②微颗粒包裹。在此处设计垂直的流道，通入连续相油对主流道中的海藻酸钠溶液进行剪切，从而可生成包裹有微颗粒的液滴。③液滴减速。为了更加精准地分选包裹不同颗粒的液滴，分选前在主流道两旁设计宽度较大的旁流道，利用分流使液滴减速。④荧光颗粒液滴的分选。在液滴经过此分选区域时，含有荧光颗粒的液滴的荧光信号将触发荧光检测系统，从而控制外加电场的开关，在电场力的作用下使此液滴流向指定的下侧流道，从而实现精准分选。
使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为制备微流控芯片的基本材料，将其与玻璃键合即可形成微流控芯片。微通道的深度设计为80μm，进样流道的宽度为100μm。芯片图案设计采用AutoCAD2007绘制，选择4英寸(1英寸=2.54cm)硅片作为微流控芯片模具的基片，用旋涂机(SC100-SE，BestTool)在硅片抛光面上旋涂80μm厚的SU-8光刻胶。将带有设计图案的菲林掩膜放置在光刻机上曝光(URE/2000-35，中国科学院)，从而将芯片图案转移到硅片上的光刻胶。通过用显影液去除未曝光部分的光刻胶，从而形成芯片模具。PDMS由于其优越的光学性能及高弹性，在制作微流控芯片上具有巨大优势。PDMS及其固化剂按质量比10∶1混合后，将其浇筑至硅片模具上。待其固化后，将其从硅片上揭开即形成带有芯片图案的PDMS薄膜，再将熔点较低的金属熔融注入相应位置处，即将微电极植入到微流控芯片上，如图2所示。
1.2实验材料及设备
在100mL水中加入1g海藻酸钠配置出实验所用的海藻酸钠溶液，海藻酸钠溶液中的微颗粒分别采用粒径20μm的普通聚苯乙烯微球和粒径26.3μm的绿色荧光聚苯乙烯微球，微颗粒浓度均约为9.69×105/mL。同时采用上述配置的海藻酸钠溶液作为鞘液，大豆油作为连续相。图3为微颗粒分选系统装配实物图，主要包括注射样品溶液的LSP04-1A注射泵和1mL注射器、用于观察液滴及相关信号分析的荧光检测系统(CP70-1HS-M-1900高速摄影仪器、荧光激发光源等)和用于液滴分选模块(HB-Z152-1AC直流高压电源、DG4000信号发生器和ATA-2161高压放大器等)。
2实验结果
2.1微颗粒聚焦及包裹
使用鞘液能将液体中的微颗粒排列到流道中某一平衡的位置上(图4)，当鞘液流流速为100μL/h时，在经过鞘液流挤压后，微颗粒在流道里表现出在中间平衡位置上成一条直线的趋势，且颗粒与颗粒之间保持一个适宜的距离。
当微颗粒在流道中呈现此状态时，即可对其进行液滴包裹。T.J.Clausell等人[9]指出液滴中包裹有不同数量目标物体的数目服从泊松分布。且有研究指出，微颗粒浓度维持一个恒定值且生成的液滴的体积与粒子在溶液中的平均体积基本相当时，包裹有单个目标物的液滴数量最多，约为生成的总液滴数量的36.8%[10-11]。
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图5展示了设计的芯片能够通过鞘液流使微颗粒聚焦，并将样品溶液中微颗粒包裹起来。当微颗粒浓度约为9.69×105/mL、分散相流速为10μL/h、连续相流速为180μL/h时，生成的海藻酸钠液滴的直径约为97.5μm。待液滴在芯片中稳定生成时，记录了单个液滴所包含微颗粒的数目，经统计发现包裹有单颗颗粒的液滴占所有液滴比例为21%，剩余79%的液滴为空液滴，并未出现包裹有两颗及以上微颗粒的液滴。在理想状态时，包含有微颗粒的数目呈泊松分布，其中λ为在此微颗粒浓度及液滴直径条件下微颗粒在单个液滴中的平均数量，经计算得λ≈0.47，根据泊松分布计算公式求得包裹有单颗颗粒的液滴比例为29.3%，未包裹颗粒的液滴比例为62.5%，包裹两颗颗粒的液滴比例为6.9%，故其实际液滴包裹颗粒的比例及理论液滴包裹颗粒的比例如表1所示。
2.2包裹颗粒的液滴减速
液滴在未进入减速区域时，其速度基本等同于连续相流速，约为6.25μm/ms;当包裹有微颗粒的液滴进入减速区域后，主流道两侧对称的分支流道起到分流作用，当流量一定时，流体在经过此区域时相当于流道截面积增大，从而使液滴在此处速度减小。图7(a)显示在0ms时，流道减速区域出现三颗液滴，包裹有微颗粒的液滴在前;图7(b)中显示在175ms时，包裹有微颗粒的液滴与前面空液滴的距离明显减小，说明空液滴在经过此区域后速度明显减小。同理，从图7(c)和图7(d)中也可看出，通过计算可得此时微颗粒液滴的瞬时速度均约为1.616μm/ms。
2.3包裹荧光颗粒的液滴分选
当液滴经过减速后即可对其进行更加精确的分选(图8)，荧光颗粒在激发光照射下激发出荧光，从而信号发生器被触发，再经信号放大器从而产生一个矩形脉冲电压(电压700V，脉宽220ms)。图9为荧光颗粒液滴分选过程，当内含荧光目标颗粒的液滴被系统检测到时，液滴在静电力的作用下流入下侧的流道;而空液滴或包裹普通颗粒的液滴则将不受静电力的影响，维持在与主流道一致的方向从流道中流出，从而将荧光颗粒从样品溶液中筛选出来。对荧光颗粒流道出口处收集到的颗粒进行观察并统计，在此实验条件下，发现分选成功率为87%，其原因可能为颗粒液滴在芯片内尚未稳定生成时，由于流体较为紊乱导致非目标颗粒进入目标通道，从而降低了分选成功率。——论文作者：钟明浩，郭钟宁，刘宇迅
文章名称：基于微流控技术的液滴微颗粒分选
